1 实验设计构思介绍
①与Aβ整个分子一样,片段Aβ25-35已被证明具有同样的神经毒性,并且被认为是整个分子的活性中心。因此我们采用一次性侧脑室注射凝聚态Aβ25–35建立AD的动物模型来评价蛇床子素抗AD的作用。②中枢突触传递长时程增强(LTP)现象是研究突触可塑性的有效模型,突触的可塑性是学习记忆的神经学基础,因此LTP常被用作在突触水平上研究学习记忆的神经机制的重要指标。我们的研究从行为学(Morris水迷宫)和电生理学(LTP)两个角度(将整体动物和突触水平结合起来)来探讨蛇床子素对Aβ25-35所致AD大鼠的学习记忆能力的改善作用,突破以往研究学习记忆单一的研究方法或手段。③Glu调控的与AD的发病机制有关兴奋性毒性的假说在科学界越来越被接受,中枢Glu/GABA学习记忆调控系统是是继胆碱能神经系统的神经递质调控学习记忆的新观点,本次研究首次从中枢Glu/GABA学习记忆调控系统探讨蛇床子素改善学习记忆的作用机制。④作为传统中药有效单体蛇床子素在一般的治疗剂量下毒副作用小,同时蛇床子素能够透过血脑屏障,这为其治疗中枢系统疾病奠定良好的药动学基础。
2 国内外同类研究水平的介绍
蛇床子素,传统中药蛇床子的有效单体,根据国内外文献报道,具有广泛药理活性,包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗血小板、抗疼痛和雌激素样等作用。国内外对于蛇床子素改善学习记忆作用的文献只局限于对血管性痴呆(缺血再灌注后引起的损伤)有一定的脑保护作用,作用机制与其抗炎作用有关,而其它方面的与改善学习记忆有关的机制未见报道。
3 本文与其他同类研究的比较
我们课题组多年一直研究蛇床子素的抗衰老、改善学习记忆作用及其机制。目前已经证实蛇床子素通过抗氧化、调节中枢胆碱系统活性而具有改善学习记忆的作用。本次研究首次将测定LTP与海马Glu和GABA含量结合起来,初步揭示蛇床子素对中枢Glu/GABA学习记忆调控系统的影响。中枢Glu和GABA的平衡对于保持包括学习记忆在内的脑正常的功能是非常重要的,在生理和病理条件下,Glu和GABA的关系是辩证的,发挥着不同的调节作用。本研究为探讨抗AD药物作用机制开拓新的研究思路和方向。
4 本文先进性、创新性及其特色
以“蛇床子素”为关键词,2009/2012,万方数据库收录文献165篇,主要报道蛇床子素药理作用(包括抗炎、抗肿瘤、抗血小板、抗疼痛和雌激素样等),蛇床子素剂型的开发,中药中蛇床子素的提取工艺,中药复方中蛇床子素含量测定等。其中与学习记忆相关文献4篇。
在摘要和题目含“蛇床子素” ,2009/2012,pubmed中收录文献有52篇,主要报道蛇床子素治疗糖尿病,改善胰岛素耐受性,抗癌,抗坐骨神经痛,抗炎和免疫调节,抗痉挛,治疗酒精肝等作用,其中与我们的研究相关的文献共计3篇。
3年内相关文献共计7篇:
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发表时间
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题目
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主要研究
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万方
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2009
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蛇床子素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用
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抗炎,减轻脑水肿
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2009
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蛇床子素在缺血再灌注脑损伤模型中的脑保护作用
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降低caspase3表达水,脑保护作用
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2010
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蛇床子素对Aβ25-35诱导的星形胶质细胞NF-κB活化机制的影响
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抑制Aβ25-35的神经毒性作用, 与抑制NF-κB的过度活化有关
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2011
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蛇床子素减轻Aβ25-35诱导的大鼠学习记忆减退及海马神经元结构损伤
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透射电镜观察海马神经元结构变化
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pubmed
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2010
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Neuroprotective effect of osthole against acute ischemic stroke on middle cerebral ischemia occlusion in rats.
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神经保护作用与抗氧化、抗炎有关
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2010
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Osthole improves chronic cerebral hypoperfusion induced cognitive deficits and neuronal damage in hippocampus.
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血管性痴呆保护作用与抗氧化、抗凋亡
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2012
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Neuroprotective effects of osthole pretreatment against traumatic brain injury in rats.
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对外伤性脑损伤具有保护作用,与抗氧化和抗凋亡有关
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我们在以往的研究中,主要是针对血管性痴呆、AlCl3致痴呆小鼠,Aβ25-35致痴呆动物模型中蛇床子素的作用和机制研究,机制主要涉及到抗氧化、抗凋亡、改善中枢胆碱能神经而具有的改善学习记忆的作用。
① 理论假设创新:目前与学习记忆的相关途径主要有:中枢胆碱能神经,中枢NMDA受体,中枢腺苷受体。前期研究我们已经证实蛇床子素改善学习记忆作用与中枢胆碱能神经有关,目前我们正在研究与中枢NMDA受体的相关性,因此从与NMDA受体相关的Glu和GABA(即中枢Glu/GABA学习记忆调控系统)入手观察海马内氨基酸水平变化,初步探讨是否具有相关性。本研究为探讨抗AD药物作用机制开拓新的研究思路和方向。
② 技术方法创新:在研究蛇床子素改善学习记忆作用的手段上,将动物整体(行为学Morris水迷宫)和突触水平(海马LTP)联系起来,同时验证了蛇床子素具有改善学习记忆障碍的作用。
③ 结果创新:研究发现蛇床子素对老年性痴呆(AD)模型大鼠学习记忆障碍具有改善作用,其机制与中枢Glu水平相关。第一次从中枢氨基酸水平研究蛇床子素的改善学习记忆障碍机制,为后续多层次,多手段研究与中枢NMDA受体的相关性奠定基础。
④ 其他创新:文献报导,侧脑室注射 Aβ25-35是制造AD动物模型的有效方法,Aβ明显地抑制海马LTP的诱导和表达,海马的LTP已被广泛作为学习记忆的神经模型,LTP的产生需要突触前Glu的释放,激动突触后NMDA受体,而Glu的过度释放会产生兴奋性毒性,导致学习记忆障碍,总之Aβ、学习记忆、LTP、Glu和NMDA受体有着密切的关联。因此我们在模型制备(侧脑室注射 Aβ25-35),检测指标(LTP、Glu)的选择上都有一定的因果相关性,为进行蛇床子素改善学习记忆作用与NMDA受体相关性研究奠定基础。
5 文章区别于他人他篇的特点
① 技术方法的不同。大鼠侧脑室缓慢注射5ul Aβ25-35,注射时间10min,停留30min后拔针,注射时间和停留时间长,这样可有效防止液体外漏,造模成功率高。
② 干预措施的不同。文献报道整体动物实验中蛇床子素的给药方式有腹腔注射,灌胃。本研究采用腹腔注射的方法,连续14天,每天注射1次。在造模后的病理发展过程中,同时给予药物干预治疗。给药剂量和次数与文献不同。
③ 结果结论的不同。研究表明,蛇床子素改善AD模型大鼠学习记忆障碍与中枢Glu水平相关,第一次从中枢氨基酸水平变化探讨蛇床子素改善学习记忆作用机制。
④ 其他方面的不同。在LTP的诱导时,采用的高频刺激参数与文献报道不同,本实验所用的高频刺激型式很接近动物海马的θ节律自发电活动,能有效地诱导海马DG的LTP。多数文献记录的LTP主要是以海马CA区,我们记录的是海马DG区颗粒细胞层的LTP。
6 专家意见及作者答复
问题1:本研究通过大鼠侧脑室注射Aβ25-35建立AD大鼠模型,通过腹腔注射蛇床子素,观察蛇床子素对AD大鼠模型空间记忆力、海马神经元死亡、LTP的影响,并研究对兴奋性氨基酸谷氨酸和抑制性氨基酸γ氨基丁酸的影响,本研究具有设计基本合理,数据充分可行,讨论有理有据,具有一定的创新,但是本研究存在不够深入,方法单一。
答:感谢您对论文提出的意见和建议。课题组多年来一直从事蛇床子素抗衰老、改善学习记忆作用的药动学和药效学研究,目前已经确定的蛇床子素改善学习记忆的作用机制是抗氧化和抗胆碱酯酶。而蛇床子素影响中枢Glu,进而影响中枢Glu/GABA调节系统是第一次提出的作用机制,目前探讨蛇床子素改善学习记忆作用与中枢Glu/GABA调节系统关系的研究正处在研究的第一阶段,接下来我们将从多个层次,运用多种手段做更深入的研究。
问题2:蛇床子素改善学习记忆研究具有10余年的历史,故本文的药效学部分缺乏新意。至于作用机制着眼于中枢GLU/GABA调节系统,也缺乏层次性与深度,单独一种手段不足以信服,所谓孤证不立。仅仅检测了Glu/GABA含量,就在题目中直言 via central Glu/GABA regulation system,显然是很不合适的,缺乏科研的严谨性。因而,机制研究也缺乏创新性与层次性,建议围绕某一作用机制开展多层次、多手段的深入研究。
答:首先感谢您对论文提出的意见和建议,对您提出的意见我做了以下解释,您的建议对于我们以后的研究有很大帮助。
课题组多年来一直从事蛇床子素抗衰老、改善学习记忆作用的药动学和药效学研究[1-2],探讨蛇床子素在改善学习记忆作用中最主要作用途径和机制。目前与学习记忆的相关途径主要有:中枢胆碱能神经,中枢NMDA受体,中枢腺苷受体。前期研究我们已经证实蛇床子素改善学习记忆作用与中枢胆碱能神经有关[3];目前我们正在研究与中枢NMDA受体的相关性,因此从与NMDA受体相关的Glu和GABA入手,观察海马内氨基酸水平变化,初步探讨是否具有相关性,同时也作为后续多层次,多手段研究与中枢NMDA受体相关性的基础。
本文首先采用一次性侧脑室注射凝聚态 Aβ25-35建立老年性痴呆AD大鼠模型,从行为学和电生理学(LTP)、即整体动物水平和细胞突触水平同时验证蛇床子素改善学习记忆的药效学作用,同时结合形态学(病理)改变加以说明,最终从中枢Glu和GABA水平变化给予机制上的阐述,有一定的由浅入深的逻辑性。
文献报导,侧脑室注射 Aβ25-35是制造AD动物模型的有效方法,Aβ明显地抑制海马LTP的诱导和表达,海马的LTP已被广泛作为学习记忆的神经模型,LTP的产生需要突触前Glu的释放,激动突触后NMDA受体,而Glu的过度释放会产生兴奋性毒性,导致学习记忆障碍,总之学习记忆、LTP、Glu和NMDA受体有着密切的关联。因此我们在模型制备,检测指标LTP、Glu的选择上都有一定的因果相关性,为进行蛇床子素改善学习记忆作用于NMDA受体相关性研究奠定基础。
[1]蛇床子素对AlCl3致急性衰老模型小鼠记忆障碍的保护作用.药学学报,2002,37(3):178-180
[2]蛇床子素在兔体内药物代谢动力学.药学学报,2003,38(8):571-573
[3]蛇床子素对学习记忆的影响及其机制分析.药学学报, 1999,34(6):405-409