长非编码RNA H19调节闭合性颅脑损伤模型小鼠诱导神经干细胞的神经发生

doi:10.4103/1673-5374.382255

摘要/Abstract

摘要：

作者曾报道诱导神经干细胞具有类似于神经干细胞的自我更新和定向分化为成熟神经元的潜力，然而脑损伤后移植诱导神经干细胞分化为成熟神经元以替代受损神经元的作用仍较为有限，此外，调控诱导神经干细胞神经发生的机制也不明确。实验对比分析了由体细胞经过体外重编程操作直接获取的诱导多能干细胞与诱导神经干细胞的全基因表达谱芯片数据，筛选出与神经发生相关的重要调控分子，随后进行功能学、双荧光素酶报告基因、RNA免疫沉淀、生物素偶联miRNA沉降、荧光原位杂交和干细胞移植等实验，以阐明诱导神经干细胞的神经发生机制，并进一步评估其对于脑损伤的治疗潜力。结果发现，与诱导多能干细胞相比，H19是诱导神经干细胞中下调最多的神经发生相关的长非编码RNA。H19在诱导神经干细胞中的水平明显低于诱导多能干细胞，但大大高于诱导神经干细胞来源的神经元。然后，实验预测了H19的靶基因，发现H19直接与miR 325 3p相互作用，而后者在诱导多能干细胞和诱导神经干细胞中可以直接与Ctbp2相互作用。沉默H19或Ctbp2损害了诱导神经干细胞的增殖，而miR-325-3p的抑制恢复了H19抑制的效果，但没有恢复Ctbp2抑制的效果。H19沉默未能诱发诱导神经干细胞的明显损伤，但却明显促进了诱导神经干细胞的神经分化。值得注意的是，在诱导神经干细胞移植中沉默H19明显促进了闭合性颅脑损伤小鼠的神经系统恢复。以上结果表明，H19可通过H19/miR3253p/Ctbp2轴调控诱导神经干细胞的神经发生。值得注意的是，沉默H19可通过H19/miR3253p/Ctbp2轴促进诱导神经干细胞分化为神经元。因而，H19/miR3253p/Ctbp2轴调控诱导神经干细胞神经发生有潜力用于创伤性脑损伤的治疗。

https://orcid.org/0000-0002-1300-5535 (Ruxiang Xu); https://orcid.org/0009-0009-3254-5535 (Zhanfeng Chen); https://orcid.org/0009-0000-1058-1169 (Mou Gao)

Abstract: Stem cell-based therapies have been proposed as a potential treatment for neural regeneration following closed head injury. We previously reported that induced neural stem cells exert beneficial effects on neural regeneration via cell replacement. However, the neural regeneration efficiency of induced neural stem cells remains limited. In this study, we explored differentially expressed genes and long non-coding RNAs to clarify the mechanism underlying the neurogenesis of induced neural stem cells. We found that H19 was the most downregulated neurogenesis-associated lncRNA in induced neural stem cells compared with induced pluripotent stem cells. Additionally, we demonstrated that H19 levels in induced neural stem cells were markedly lower than those in induced pluripotent stem cells and were substantially higher than those in induced neural stem cell-derived neurons. We predicted the target genes of H19 and discovered that H19 directly interacts with miR-325-3p, which directly interacts with Ctbp2 in induced pluripotent stem cells and induced neural stem cells. Silencing H19 or Ctbp2 impaired induced neural stem cell proliferation, and miR-325-3p suppression restored the effect of H19 inhibition but not the effect of Ctbp2 inhibition. Furthermore, H19 silencing substantially promoted the neural differentiation of induced neural stem cells and did not induce apoptosis of induced neural stem cells. Notably, silencing H19 in induced neural stem cell grafts markedly accelerated the neurological recovery of closed head injury mice. Our results reveal that H19 regulates the neurogenesis of induced neural stem cells. H19 inhibition may promote the neural differentiation of induced neural stem cells, which is closely associated with neurological recovery following closed head injury.

Key words: closed head injury, Ctbp2, induced neural stem cell, lncRNA H19, miR-325-3p, neurogenesis

. 长非编码RNA H19调节闭合性颅脑损伤模型小鼠诱导神经干细胞的神经发生[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2024, 19(4): 872-880.

Mou Gao, Qin Dong, Zhijun Yang, Dan Zou, Yajuan Han, Zhanfeng Chen, Ruxiang Xu. Long non-coding RNA H19 regulates neurogenesis of induced neural stem cells in a mouse model of closed head injury[J]. Neural Regeneration Research, 2024, 19(4): 872-880.

参考文献

引言

出版重点

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延伸阅读

NRR：四川省人民医院徐如祥团队提出H19/miR3253p/Ctbp2轴调控诱导神经干细胞神经发生有潜力用于治疗创伤性脑损伤

既往研究证明干细胞移植对创伤性脑损伤后神经功能恢复有潜在治疗作用。作者曾报道诱导神经干细胞(iNSCs)可以通过细胞替代作用促进创伤性脑损伤后神经修复。然而，iNSCs向成熟神经元分化的效率仍然较低，限制了其临床应用。四川省人民医院的徐如祥团队在发表于《中国神经再生研究（英文版）》（Neural Regeneration Research）2024年第4期的最新研究中，通过对比分析同样是由体细胞经过体外重编程操作直接获取的诱导多能干细胞（iPSCs）与iNSCs的全基因表达谱芯片数据，筛选出与神经发生相关的重要调控分子，随后进行功能学、双荧光素酶报告基因、RNA免疫沉淀（RIP）、生物素偶联miRNA沉降(miRNA pulldown)、荧光原位杂交(FISH)和干细胞移植等实验，以阐明iNSCs的神经发生机制，并进一步评估其对于创伤性脑损伤的治疗潜力。

研究背景

1.创伤性脑损伤的发病率和致残致死率一直高居不下，严重制约国民经济和社会发展。虽然脑损伤后神经再生修复尚未攻克，但近来随着再生医学的发展，尤其是干细胞和细胞重编程技术的突破，给人们带来了新的希望。作者曾报道iNSCs具有类似于神经干细胞(NSCs)的自我更新和定向分化为成熟神经元的潜力，然而创伤性脑损伤后移植iNSCs分化为成熟神经元以替代受损神经元的作用仍较为有限，此外，调控iNSCs神经发生的机制也不明确。

2.近年来有学者报道细胞重编程技术可能会影响iPSCs和iNSCs的基因表达。为了评估细胞重编程技术对二者基因表达的影响，作者曾进行了微阵列分析，发现iPSCs与胚胎干细胞的基因表达近乎一致，而iNSCs则与NSCs的基因表达高度相似。此外，大多数在iPSCs中上调的基因在iNSCs中下调，反之亦然。例如，在iPSCs中，与干性和增殖相关的mRNAs(包括Oct4和Nanog)的水平显著高于iNSCs，而与神经发生相关的mRNAs(包括Brn2、Ncan、Nkx2-2、Tox3、Tubb3、Map2和Syp)的水平显著低于iNSCs。此外，一些在iPSCs与iNSCs差异表达的长链非编码RNA(lncRNAs)与这些mRNAs具有相关性。

3.越来越多的证据表明lncRNAs在神经发生中发挥重要调控作用。例如lncRNA 1604、Meg3和Rik-201可能分别通过靶向miR-200c、miR-128-3p和miR-96促进神经发生。LncRNA H19可能通过影响染色质重塑蛋白和miRNA表达而促进神经发生。然而，有学者报道H19可能通过抑制p53/Notch1通路阻止神经发生，这表明H19对神经发生的影响尚存争议。此外，H19可能作为竞争性内源RNA发挥分子海绵的作用调控miR-19a或let-7b，以促进缺氧、缺血或癫痫引起的神经细胞凋亡。相反，H19可以维持NSCs和胶质母细胞瘤的干性和细胞增殖，这表明H19在中枢神经系统中可能发挥多种作用。

研究方法

1.通过对比分析iPSCs与iNSCs的全基因表达谱芯片数据，筛选出与神经发生相关的重要调控分子。

2.通过功能学、双荧光素酶报告基因、RIP、miRNA pulldown和FISH等实验，探索H19调控神经发生的机制。

3.建立创伤性脑损伤小鼠模型，并通过立体定向方式将H19敲低的iNSCs移植入脑损伤区域。应用神经功能缺损评分（NSS）和步态实验评估H19敲低的iNSCs对小鼠神经功能恢复的治疗作用。免疫荧光法评估脑损伤区GFP标记的H19敲低的iNSCs向NeuN阳性成熟神经元的分化情况。

结果表明，相比iPSCs，iNSCs中H19是与神经发生相关的lncRNAs中下调最明显的基因。RT-qPCR验证发现H19在iNSCs中的表达水平明显低于iPSCs，但明显高于iNSCs来源的神经元。并且在iPSCs和iNSCs中，H19可以直接与miR-325-3p作用，而miR-325-3p可以直接与Ctbp2作用。此外，沉默H19或Ctbp2将抑制iNSCs细胞增殖，而抑制miR-325-3p可减轻沉默H19的作用，但对沉默Ctbp2的作用则无效。此外，沉默H19在iNSCs中没有出现明显的细胞损伤，但明显促进了iNSCs向神经元方向分化。在iNSCs移植实验中发现沉默H19的iNSCs明显促进了创伤性脑损伤小鼠的神经功能恢复。此外，在脑损伤区可见H19敲低的iNSCs向NeuN阳性成熟神经元的分化效率明显提高了。

总结

研究结果证实在iPSCs和iNSCs中H19可作为miR-325-3p的分子海绵，而miR-325-3p可以直接靶向作用于Ctbp2。因此，H19可通过H19/miR3253p/Ctbp2轴调控iNSCs的神经发生。值得注意的是，沉默H19可通过H19/miR3253p/Ctbp2轴促进iNSCs分化为神经元。总之，该研究揭示了调控iNSCs神经发生的新的lncRNA-miRNA-mRNA网络，提出了可以通过调节H19、miR3253p和Ctbp2水平影响iNSCs向神经元方向分化的新思路。

图片说明：生物信息学分析诱导多能干细胞(iPSCs)和诱导神经干细胞(iNSCs)差异表达的 mRNAs和lncRNAs。

图片说明：H19及其靶miRNA在诱导多能干细胞(iPSCs)、诱导神经干细胞(iNSCs)和iNSCs来源的神经元中的表达模式。

图片说明：H19在诱导多能干细胞(iPSCs)和诱导神经干细胞(iNSCs)中可以直接与miR-325-3p相互作用。

图片说明：与H19共表达的mRNA在诱导多能干细胞(iPSCs)、诱导神经干细胞(iNSCs)和iNSCs来源的神经元中的表达模式。

图片说明：Ctbp2在诱导多能干细胞(iPSCs)和诱导神经干细胞(iNSCs)中直接与miR-325-3p相互作用。

图片说明：H19作为miR-325-3p的分子海绵，靶向调控Ctbp2，影响诱导神经干细胞(iNSCs)的神经发生。

图片说明：H19/miR-325-3p/Ctbp2轴调控诱导神经干细胞(iNSCs)的增殖和向神经元方向分化。

图示摘要

基金支持：该研究获得国家自然科学基金（82271397，82001293，82171355，81971295和81671189）的资助。

徐如祥，电子科技大学四川省人民医院神经外科主任，教授，博士生导师，四川省千人计划特聘专家。#br# 从事神经外科医疗、教学及科研工作40余年。研究方向：神经外科学、颅脑损伤与修复、脑功能性疾病与脑机接口治疗技术。是中枢神经损伤干细胞移植修复研究领域中国首席专家，在中枢神经损伤与修复领域取得显著成绩。是中国移动CT的首席发明专家，自主研发成功小型化、低辐射、低能耗、导轨精准控制扫描及三向减震的高端小型16排断层移动CT。先后承担国家重大（点）课题、国自然重点及面上项目、部省级重点科研课题等20项。发表论文300余篇，其中SCI 论文130余篇，主编专著7部。获国家发明专利、国防保密专利及国际专利50余项。获国家科技进步二等奖1项，省部级一等奖2项，二等奖11项。担任“国家互联网+移动卒中救治联盟”主任委员（第二位），中国神经科学学会副理事长兼神经创伤与修复分会主任委员、中华医学会神经外科分会常委兼任神经创伤专业组组长、全军神经外科专业委员会副主任委员、北京市医学会神经外科分会副主任委员。担任《中华神经医学杂志》、《中华神经创伤外科电子杂志》及《中华脑科疾病与康复杂志》总编辑。入选国家级百千万人才工程、第三届中国医师奖、享受国务院特殊津贴。荣获国家荣誉勋章1枚、国防奖章1枚。荣立二等功1次，三等功3次。