牙髓干细胞刺激PC12细胞的神经元分化

doi:10.4103/1673-5374.306089

摘要/Abstract

摘要：

牙髓干细胞（DPSC）分泌神经营养因子，可能在神经发育、维持和修复中起重要的治疗作用。为了解牙髓干细胞衍生因子对PC12存活、生长、迁移和分化的影响。用神经生长因子或牙髓干细胞-CM处理PC12细胞或以Transwell插入物与牙髓干细胞共培养8天。通过图像分析来测量具有神经突生长的存活细胞的数目和神经突的长度。免疫细胞化学染色评价神经元标志物NeuN，微管相关蛋白 2和细胞骨架标志物βIII-微管蛋白的表达。通过qRT-PCR分析了轴突生长相关蛋白43（GAP-43）和突触蛋白Synapsin-1，NeuN，微管相关蛋白 2和βIII-微管蛋白的基因表达水平。通过特异性ELISA分析牙髓干细胞-CM的神经营养因子神经生长因子、脑源性神经营养因子、NT-3和神经胶质源神经营养因子。针对检测到的神经营养因子的特异性中和抗体被用于研究其对PC12神经元存活和神经突向外延伸的确切作用。牙髓干细胞-CM可显著促进细胞存活，并诱导神经突生长。同时，牙髓干细胞-CM在刺激PC12神经突生长方面比牙髓干细胞/PC12共培养物更为有效。牙髓干细胞-CM诱导的PC12细胞的形态与神经生长因子阳性对照相似。但是，牙髓干细胞-CM对细胞存活的刺激作用明显高于神经生长因子处理的培养物。通过添加抗神经胶质源神经营养因子明显减少了用牙髓干细胞-CM处理的存活PC12细胞的数量，而抗神经生长因子、抗神经胶质源神经营养因子和抗脑源性神经营养因子抗体明显减少了PC12神经突的生长。这些结果证明牙髓干细胞能够促进PC12的存活和分化。牙髓干细胞衍生的神经生长因子、神经脑源性神经营养因子和神经胶质源神经营养因子参与了对神经突生长的刺激作用，而神经胶质源神经营养因子在促进PC12的存活中也起着重要的作用。牙髓干细胞衍生因子可用于无细胞疗法修复周围神经缺损。

https://orcid.org/0000-0003-0965-9170 (Nessma Sultan)

Abstract: Dental pulp stem cells (DPSCs) secrete neurotrophic factors which may play an important therapeutic role in neural development, maintenance and repair. To test this hypothesis, DPSCs-conditioned medium (DPSCs-CM) was collected from 72 hours serum-free DPSCs cultures. The impact of DPSCs-derived factors on PC12 survival, growth, migration and differentiation was investigated. PC12 cells were treated with nerve growth factor (NGF), DPSCs-CM or co-cultured with DPSCs using Transwell inserts for 8 days. The number of surviving cells with neurite outgrowths and the length of neurites were measured by image analysis. Immunocytochemical staining was used to evaluate the expression of neuronal markers NeuN, microtubule associated protein 2 (MAP-2) and cytoskeletal marker βIII-tubulin. Gene expression levels of axonal growth-associated protein 43 and synaptic protein Synapsin-I, NeuN, MAP-2 and βIII-tubulin were analysed by quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). DPSCs-CM was analysed for the neurotrophic factors (NGF, brain-derived neurotrophic factor [BDNF], neurotrophin-3, and glial cell-derived neurotrophic factor [GDNF]) by specific ELISAs. Specific neutralizing antibodies against the detected neurotrophic factors were used to study their exact role on PC12 neuronal survival and neurite outgrowth extension. DPSCs-CM significantly promoted cell survival and induced the neurite outgrowth confirmed by NeuN, MAP-2 and βIII-tubulin immunostaining. Furthermore, DPSCs-CM was significantly more effective in stimulating PC12 neurite outgrowths than live DPSCs/PC12 co-cultures over the time studied. The morphology of induced PC12 cells in DPSCs-CM was similar to NGF positive controls; however, DPSCs-CM stimulation of cell survival was significantly higher than what was seen in NGF-treated cultures. The number of surviving PC12 cells treated with DPSCs-CM was markedly reduced by the addition of anti-GDNF, whilst PC12 neurite outgrowth was significantly attenuated by anti-NGF, anti-GDNF and anti-BDNF antibodies. These findings demonstrated that DPSCs were able to promote PC12 survival and differentiation. DPSCs-derived NGF, BDNF and GDNF were involved in the stimulatory action on neurite outgrowth, whereas GDNF also had a significant role in promoting PC12 survival. DPSCs-derived factors may be harnessed as a cell-free therapy for peripheral nerve repair. All experiments were conducted on dead animals that were not sacrificed for the purpose of the study. All the methods were carried out in accordance with Birmingham University guidelines and regulations and the ethical approval is not needed.

Key words: brain-derived neurotrophic factor, conditioned medium, dental pulp stem cell, glial cell line-derived nerve growth factor, neurite outgrowth, neurotrophic factor, neurotrophin-3, phaeochromocytoma PC12 cell

牙髓干细胞刺激PC12细胞的神经元分化 [J]. 中国神经再生研究(英文版), 2021, 16(9): 1821-1828.

Nessma Sultan, Laila E. Amin, Ahmed R. Zaher, Mohammed E. Grawish, Ben A. Scheven. Dental pulp stem cells stimulate neuronal differentiation of PC12 cells[J]. Neural Regeneration Research, 2021, 16(9): 1821-1828.

参考文献

引言

出版重点

《中国神经再生研究（英文版）》杂志为SCI、PubMed数据库收录的国际唯一一本专注神经再生领域研究的经同行评议的开放获取期刊，出版来自全球神经再生领域专业学者的前沿性基础研究及临床研究及转化医学、循证医学优秀的最新成果。

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延伸阅读

Neural Regen Res：牙髓干细胞衍生因子可用于无细胞疗法修复周围神经缺损

原代和基因修饰的许旺细胞都可以增强动物模型的神经再生。但是，许旺细胞的来源和可用性受到限制，获得原代细胞的唯一方法是牺牲健康的神经。基于干细胞的策略与新技术（例如水凝胶）的结合为促进神经再生和修复提供了潜在的新治疗方法。骨髓干细胞（BMSC）、脂肪干细胞（ADSC）和牙髓干细胞（DPSC）受到了越来越多的关注。

特别是，牙髓干细胞能够分泌出对神经元存活和轴突再生有效的大量神经营养因子，在神经科学研究领域引起了广泛关注。

嗜铬细胞瘤（PC12）细胞系是一种众所周知的神经元细胞模型，起源于肾上腺肿瘤，已被广泛用作研究神经元分化的模型，但从未用于牙髓干细胞的研究。神经生长因子是一种神经营养因子，对于交感神经和感觉神经元的存活和维持至关重要，并且它与高亲和力酪氨酸激酶受体TrkA结合，从而使其磷酸化并随后激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/Akt）途径。反过来，这促进了神经突向外生长所需的细胞骨架重排。

为了解牙髓干细胞衍生因子对PC12存活、生长、迁移和分化的影响。英国伯明翰大学的Ben A. Scheven等用神经生长因子或牙髓干细胞-CM处理PC12细胞或以Transwell插入物与牙髓干细胞共培养8天。发现牙髓干细胞-CM可显著促进细胞存活，并诱导神经突生长。同时，牙髓干细胞-CM在刺激PC12神经突生长方面比牙髓干细胞/PC12共培养物更为有效。牙髓干细胞-CM诱导的PC12细胞的形态与神经生长因子阳性对照相似。但是，牙髓干细胞-CM对细胞存活的刺激作用明显高于神经生长因子处理的培养物。通过添加抗神经胶质源神经营养因子明显减少了用牙髓干细胞-CM处理的存活PC12细胞的数量，而抗神经生长因子、抗神经胶质源神经营养因子和抗脑源性神经营养因子抗体明显减少了PC12神经突的生长。这些结果证明牙髓干细胞能够促进PC12的存活和分化。牙髓干细胞衍生的神经生长因子、神经脑源性神经营养因子和神经胶质源神经营养因子参与了对神经突生长的刺激作用，而神经胶质源神经营养因子在促进PC12的存活中也起着重要的作用。牙髓干细胞衍生因子可用于无细胞疗法修复周围神经缺损。

上述研究结果发表于《中国神经再生研究（英文版）》杂志2021年第9期。