文章重点内容的中文介绍: 糖尿病周围神经病变(DPN)的发病机制尚未完全阐明,每一种学说都不能解释DPN发生和发展的全貌,多数研究认为是诸多因素共同作用的结果。2001年,Brownlee 提出的糖尿病血管并发症的统一机制学说,认为高糖引起线粒体电子传递呼吸链超氧阴离子生成过多,引发组织细胞发生氧化应激, 激活引起糖尿病慢性并发症的四条经典途径,即多元醇通路、己糖胺旁路、AGEs途径、蛋白激酶C途径,最终导致糖尿病各种并发症的发生。神经组织中线粒体含量丰富,而线粒体是产生ROS的主要场所,也更易受到氧化应激反应的攻击。由氧化应激损伤所造成的神经细胞的凋亡最终导致了DPN的发生发展。线粒体是启动细胞凋亡过程的中枢通路和主要途径,线粒体膜电位降低是启动细胞凋亡的关键环节;bcl-2和bax是细胞凋亡过程中的正、负调控因子;caspase-9 介导线粒体途径的凋亡信号;caspase-3是最下游的凋亡执行信号分子和关键蛋白酶。本研究发现高糖增加了许旺细胞的氧化应激水平,并通过对线粒体凋亡通路的影响增加了许旺细胞的凋亡,而且这种作用与渗透压无关。葛根素可以通过降低线粒体氧化应激水平,抑制线粒体途径的细胞凋亡,从而发挥对高糖所导致的许旺细胞损伤的保护作用。
实验设计及文章构思: 本课题以周围神经的髓鞘形成细胞-许旺细胞作为靶细胞,研究了高糖对许旺细胞氧化应激及凋亡的影响,并观察了中药单体葛根素的干预作用。实验设计是原代培养许旺细胞,高糖环境培养48小时,同时加入不同浓度葛根素进行干预,并以甘露醇作为渗透压对照。通过流式细胞术检测细胞内活性氧水平及线粒体膜电位变化,Elisa法检测氧化应激损伤的特异性标志物8羟基脱氧尿苷的含量,TUNEL法检测细胞凋亡,实时荧光定量PCR法检测bcl-2及bax mRNA的表达;Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-9及caspase-3的表达。从而观察高糖对促进许旺细胞氧化应激损伤及凋亡的作用,及中药单体葛根素对高糖所造成许旺细胞损伤的干预作用。
课题设计中区别于国内外相关研究的特点: 本课题采用50mM的葡萄糖作为高糖环境观察其对许旺细胞氧化应激损伤及细胞凋亡的作用。通过DHE探针直接检测细胞内超氧化物阴离子水平,并检测了氧化应激特异性标志物8羟基脱氧尿苷的含量,从两方面证实了细胞氧化应激损伤的存在。通过对线粒体膜电位及线粒体凋亡途径上的关键蛋白如bcl-2、bax、caspase-9、caspase-3的检测,探讨了线粒体途径在高糖诱导的许旺细胞凋亡中的作用。同时首次在细胞水平上对中药单体葛根素对高糖诱导的许旺细胞氧化应激损伤及凋亡的干预作用进行了研究。
文章学术水平与国内外同类研究的比较:本文从细胞水平上系统的探讨了高糖可以通过促进氧化应激反应从而促进了许旺细胞的凋亡,而线粒体途径在此过程中起着重要作用。高糖可以通过降低线粒体膜电位、促进线粒体凋亡途径相关蛋白bax、caspase-9及caspase-3的表达,抑制线粒体抑制凋亡蛋白bcl-2的表达,从线粒体caspase依赖性途径促进许旺细胞的凋亡。而中药单体葛根素可以通过对以上途径的抑制从而起到神经保护作用。目前国内外研究中尚未见到中药单体葛根素对高糖培养许旺细胞氧化应激损伤及凋亡的干预作用的研究。
创新性报告:Pubmed检索时间范围是最近10年的文献。检索关键词是许旺细胞,高糖,氧化应激,凋亡及葛根素。其中许旺细胞检出文献6855篇,高糖检出37872篇,氧化应激检出80337篇,葛根素检出503篇。以许旺细胞、高糖联合检索出文献21篇;以许旺细胞、高糖、凋亡联合检索出文献5篇;许旺细胞、高糖、凋亡、氧化应激作为联合检索词检出文献2篇,以许旺细胞,高糖,氧化应激,凋亡及葛根素作为联合检索词检出文献0篇。
外审专家问题及答疑:
问题:Fig. 3中,TUNEL分析的细胞凋亡结果(细胞照片)比较模糊,难以支持文章结论。建议改用一些定量的凋亡分析检测方法(如流式分析),使结果更加明确。
回复:课题在预实验阶段采用Annexin-v/PI通过流式分析了高糖诱导的细胞凋亡,发现高糖诱导的细胞凋亡是以晚期凋亡为主,而流式细胞术主要检测早期凋亡,不适于检测晚期凋亡。因此在后面的凋亡检测中使用了 TUNEL法。