整合素结合肽促进大鼠原代皮质血管内皮细胞的生长和血管样网络形成

doi:10.4103/1673-5374.355760

摘要/Abstract

摘要： 大脑中的新生血管和血管生成是大脑正常发育和损伤后修复/再生的重要生理过程。整合素作为细胞表面黏附受体，参与细胞存活和生长，以及组织器官的分化和形成。实验使用整合素结合阵列平台来确定促进大鼠原代脑微血管内皮细胞（BMECs）的黏附、生长、发育和管状血管网的形成的重要整合素类型及其结合肽。BMECs是在出生后第7天从大鼠大脑中分离出来的。细胞在一个定制设计的整合素阵列系统中培养，该系统含有与脊椎动物细胞上普遍表达的16种整合素结合的短合成肽。培养7天后，对BMECs内皮细胞标记物Von Willibrand因子（VWF）和血小板内皮细胞粘附分子（PECAM-1）进行免疫染色。以BrdU法评估细胞增殖。在测试的16个整合素中，α5β1、αvβ5和αvβ8明显促进了ECs增殖。为了研究整合素结合肽在促进血管新生和血管生成方面的作用，将上述3种整合素的结合肽固定在我们定制设计的水凝胶上，在BMECs的3-D培养中加入血管内皮生长因子（VEGF）。在为期7d的三维培养后，对培养物进行固定和处理，用VWF或PECAM-1对phalloidin进行双标染色。在与整合素结合肽共轭的水凝胶中进行三维培养时，BMECs形成了相互连接的血管状网络，其管腔清晰可辨，与体内脑微血管网络近似。利用新的整合素结合阵列系统，已经确定了BMECs上介导细胞粘附和生长的特定类型的整合素，然后使用结合肽对三维水凝胶培养系统进行功能化处理，使BMECs在三维培养中形成强大的生长和管腔化的微血管状网络。该技术可用于移植体或脑部病变的体外和体内血管化，以促进神经系统损伤后的脑组织再生。

https://orcid.org/0000-0002-3837-7319 (Dong Sun)

Abstract: Neovascularization and angiogenesis in the brain are important physiological processes for normal brain development and repair/regeneration following insults. Integrins are cell surface adhesion receptors mediating important function of cells such as survival, growth and development during tissue organization, differentiation and organogenesis. In this study, we used an integrin-binding array platform to identify the important types of integrins and their binding peptides that facilitate adhesion, growth, development, and vascular-like network formation of rat primary brain microvascular endothelial cells. Brain microvascular endothelial cells were isolated from rat brain on post-natal day 7. Cells were cultured in a custom-designed integrin array system containing short synthetic peptides binding to 16 types of integrins commonly expressed on cells in vertebrates. After 7 days of culture, the brain microvascular endothelial cells were processed for immunostaining with markers for endothelial cells including von Willibrand factor and platelet endothelial cell adhesion molecule. 5-Bromo-2′-dexoyuridine was added to the culture at 48 hours prior to fixation to assess cell proliferation. Among 16 integrins tested, we found that α5β1, αvβ5 and αvβ8 greatly promoted proliferation of endothelial cells in culture. To investigate the effect of integrin-binding peptides in promoting neovascularization and angiogenesis, the binding peptides to the above three types of integrins were immobilized to our custom-designed hydrogel in three-dimensional (3D) culture of brain microvascular endothelial cells with the addition of vascular endothelial growth factor. Following a 7-day 3D culture, the culture was fixed and processed for double labeling of phalloidin with von Willibrand factor or platelet endothelial cell adhesion molecule and assessed under confocal microscopy. In the 3D culture in hydrogels conjugated with the integrin-binding peptide, brain microvascular endothelial cells formed interconnected vascular-like network with clearly discernable lumens, which is reminiscent of brain microvascular network in vivo. With the novel integrin-binding array system, we identified the specific types of integrins on brain microvascular endothelial cells that mediate cell adhesion and growth followed by functionalizing a 3D hydrogel culture system using the binding peptides that specifically bind to the identified integrins, leading to robust growth and lumenized microvascular-like network formation of brain microvascular endothelial cells in 3D culture. This technology can be used for in vitro and in vivo vascularization of transplants or brain lesions to promote brain tissue regeneration following neurological insults.

Key words: 3D culture, angiogenesis, brain microvascular endothelial cells, hydrogel, integrins, platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1), vascular endothelial growth factor (VEGF), vascularization

. 整合素结合肽促进大鼠原代皮质血管内皮细胞的生长和血管样网络形成[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2023, 18(5): 1052-1056.

Ram Kuwar, Xuejun Wen, Ning Zhang, Dong Sun. Integrin binding peptides facilitate growth and interconnected vascular-like network formation of rat primary cortical vascular endothelial cells in vitro[J]. Neural Regeneration Research, 2023, 18(5): 1052-1056.

参考文献

引言

出版重点

《中国神经再生研究（英文版）》杂志为SCI、PubMed数据库收录的国际唯一一本专注神经再生领域研究的经同行评议的开放获取期刊，出版来自全球神经再生领域专业学者的前沿性基础研究及临床研究及转化医学、循证医学优秀的最新成果。

期刊出版来自于脑损伤与神经再生、脊髓损伤与神经再生、周围神经损伤与神经再生和神经退行性病与神经再生、神经影像与神经再生的相关研究。期刊关注神经损伤与再生过程中的轴突再生、突触生长、神经可塑性、神经修复和替代、神经移植等最新研究成果。尤其关注应用细胞治疗、基因治疗、生物因子治疗、药物治疗、手术治疗、康复治疗、物理疗法、组织工程、生物工程、生物材料、神经假体等干预性方法产生神经再生效果的相关研究。文章应清晰描述抑制神经元损伤、减轻神经元损伤的一系列变化，保护损伤神经元的过程、方法、程度与评价，突出从细胞分子水平以及分子生物学水平解释神经元损伤后以及预后再生的机制。

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延伸阅读

NRR：美国弗吉尼亚联邦大学Dong Sun团队利用整合素结合肽模拟血管网络形成

脑血管和神经系统疾病或脑创伤导致的神经血管功能障碍具有复杂的病理机制，而血管生成是神经系统疾病再生过程中的一个重要方面。新生血管和血管生成的特点是细胞外基质（ECM）的重塑，血管内皮细胞（ECs）的增殖和迁移，然后是管腔的形成和功能的成熟，这些过程需要粘合分子如整合素的参与。最近的研究表明，被称为整合素结合肽的短肽能与启动血管生成信号的整合素特异性结合。

作为神经系统疾病后脑组织再生的最初步骤，重建原代脑微血管内皮细胞（BMECs）的血管网络是关键。现有的脑微血管内皮细胞血管网络工程策略主要依赖于Matrigel，其是一种从小鼠肉瘤细胞中提取的具有异质性成分的可溶性基底膜基质。然而，小鼠肿瘤起源和Matrigel的异质性组成使其无法用于临床转化。作为替代方案，美国弗吉尼亚联邦大学Dong Sun团队之前开发了一个整合素结合阵列系统，该系统可以识别特定类型的整合素及其结合肽，可以更好地支持特定类型细胞的生长。利用这个阵列，Dong Sun等在以往研究中已经确定了支持人类和动物的几种原始细胞最佳生长的整合素肽，这些细胞已知难以在常规培养器上培养，包括人类诱导多能干细胞（hiPSCs）、hiPSC源性神经上皮祖细胞（NEPs）和大鼠原代皮质神经元。

血管化是神经系统损伤后启动大脑再生的关键步骤，为了促进这一过程，有必要确定能够刺激脑微血管内皮细胞最佳生长的因素。 Dong Sun等在发表于《中国神经再生研究（英文版）》杂志2023年5期的研究中评估了从7d龄幼鼠大脑皮质中分离出来的原代脑微血管内皮细胞在整合素结合阵列上的生长情况。为了进一步证实整合素结合肽对脑微血管内皮细胞生长的支持作用，还将确定的3种特定类型的整合素（α5β1，αvβ5和αvβ8）及其结合肽固定在合成水凝胶中，用于脑微血管内皮细胞的三维培养。发现这些整合素结合肽支持脑微血管内皮细胞的强劲生长，并在水凝胶的三维培养中形成腔化的互连血管样网络。该技术可用于移植体或脑部病变的体外和体内血管化，以促进神经系统损伤后的脑组织再生。