双光子激发荧光激光扫描显微镜与缺血性脑卒中后脑支持系统：从静态到动态的活体观察

doi:10.4103/1673-5374.369099

摘要/Abstract

摘要：

缺血性脑卒中是世界范围内导致死亡和残疾的最重要原因之一；然而，治疗效果和研究进展仍然不能令人满意。作为神经血管单元的关键支持系统和重要组成部分，胶质细胞、血管（包括血脑屏障）缺血性脑卒中后，多种损伤机制共同发挥作用，除了重要的神经元组分的细胞死亡外，神经支持系统也发挥了重要作用，其过程包括维持大脑平衡、支持神经元功能和对损伤作出反应。然而，以往的研究大多集中在死后动物身上，不可避免地缺乏大量关于缺血性脑卒中后动态变化的关键信息。因此，迫切需要一种用于活体动物研究的高精度技术。双光子激发荧光激光扫描显微镜（2PLSM）是一种强大的成像技术，可以实现高时空分辨率的活体观察，提供大脑皮层的三维结构信息、多细胞成分间的通讯信息，实现结构和功能的共成像。这种技术将现有的研究模式从静态转向动态，从平面转向立体，从单细胞功能转向多细胞相互交流，从而为确定完整大脑缺血性脑卒中后的病理生理机制提供了直接和可靠的证据。文章讨论了使用2PLSM系统对缺血性脑卒中后支持系统进行研究的重大发现，强调了对大脑支持系统网络中的细胞行为和细胞相互作用进行动态观察的重要性。展示了2PLSM良好的应用前景和优势，并预测了缺血性脑卒中研究未来发展方向和研究热点。

https://orcid.org/0000-0002-4153-8590 (Zhou-Ping Tang)

Abstract: Ischemic stroke is one of the most common causes of mortality and disability worldwide. However, treatment efficacy and the progress of research remain unsatisfactory. As the critical support system and essential components in neurovascular units, glial cells and blood vessels (including the blood-brain barrier) together maintain an optimal microenvironment for neuronal function. They provide nutrients, regulate neuronal excitability, and prevent harmful substances from entering brain tissue. The highly dynamic networks of this support system play an essential role in ischemic stroke through processes including brain homeostasis, supporting neuronal function, and reacting to injuries. However, most studies have focused on postmortem animals, which inevitably lack critical information about the dynamic changes that occur after ischemic stroke. Therefore, a high-precision technique for research in living animals is urgently needed. Two-photon fluorescence laser-scanning microscopy is a powerful imaging technique that can facilitate live imaging at high spatiotemporal resolutions. Two-photon fluorescence laser-scanning microscopy can provide images of the whole-cortex vascular 3D structure, information on multicellular component interactions, and provide images of structure and function in the cranial window. This technique shifts the existing research paradigm from static to dynamic, from flat to stereoscopic, and from single-cell function to multicellular intercommunication, thus providing direct and reliable evidence to identify the pathophysiological mechanisms following ischemic stroke in an intact brain. In this review, we discuss exciting findings from research on the support system after ischemic stroke using two-photon fluorescence laser-scanning microscopy, highlighting the importance of dynamic observations of cellular behavior and interactions in the networks of the brain’s support systems. We show the excellent application prospects and advantages of two-photon fluorescence laser-scanning microscopy and predict future research developments and directions in the study of ischemic stroke.

Key words: astrocytes, blood-brain barrier, calcium signaling, glymphatic system, ischemic stroke, microglia, network, remodel, two-photon fluorescence laser-scanning microscopy, vessels

. 双光子激发荧光激光扫描显微镜与缺血性脑卒中后脑支持系统：从静态到动态的活体观察[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2023, 18(10): 2093-2107.

Xuan Wu, Jia-Rui Li, Yu Fu, Dan-Yang Chen, Hao Nie, Zhou-Ping Tang. From static to dynamic: live observation of the support system after ischemic stroke by two photon-excited fluorescence laser-scanning microscopy[J]. Neural Regeneration Research, 2023, 18(10): 2093-2107.

参考文献

引言

出版重点

《中国神经再生研究（英文版）》杂志为SCI、PubMed数据库收录的国际唯一一本专注神经再生领域研究的经同行评议的开放获取期刊，出版来自全球神经再生领域专业学者的前沿性基础研究及临床研究及转化医学、循证医学优秀的最新成果。

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延伸阅读

NRR：“从静态到动态”：华中科技大学唐洲平团队揭示双光子显微镜在缺血性脑卒中后脑支持系统研究的应用前景

撰写：吴璇，李佳芮，付余，陈丹阳，聂昊，唐洲平

缺血性脑卒中（ischemic stroke, IS）是全球发病和死亡的重要原因[1]。目前，在时间窗内进行再灌注治疗以抢救缺血半暗带区的神经元被推荐为一线治疗[2-4]。然而，许多患者由于禁忌症无法进行再灌注治疗；即使进行紧急再灌注治疗，仍有相当一部分患者预后不良[5-9]。仅仅去除缺血的始动因素、关注受损神经元，而不解决后续的级联损伤反应，不足以达成理想预后。作为大脑的关键支持系统和神经血管单元的重要组成部分，血管、胶质细胞共同为维持神经元的功能创造了一个最佳的微环境[10-17]。大脑中支持系统形成了复杂、高度异质、多组分、动态、定向的拓扑异质网络，确保了神经元的强大功能，参与IS的病理生理过程[14, 18-21]。关于IS后大脑支持系统网络的动态和精细变化的直接和可靠信息只能在活体大脑中获得。然而，常用研究范式无法提供高时空分辨率的活体观察。双光子激发荧光激光扫描显微镜（Two photon-excited fluorescence laser-scanning microscopy, 2PLSM）是一种强大的成像技术，可以实现高时空分辨率的活体观察，提供大脑皮层的三维结构信息、多细胞成分间的通讯信息，实现结构和功能的共成像[22, 23] 。这种技术将现有的研究模式从静态转向动态，从平面转向立体，从单细胞功能转向多细胞通讯，从而为确定完整大脑IS后的病理生理机制提供了直接可靠的证据。

近期，华中科技大学附属同济医院唐洲平团队在《中国神经再生研究（英文版）》（Neural Regeneration Research）上发表了题为“From static to dynamic: live observation of the support system after ischemic stroke by two photon-excited fluorescence laser-scanning microscopy”的综述文章，通过总结和分析近年2PLSM对IS的活脑组织研究，作者发现，主要以血管和胶质细胞为代表的神经支持系统在IS后的不同时空节点发挥了不同的作用，对IS后神经元命运产生了不同影响。该文带来的启示：在进行IS研究时，需要认识到脑组织形成庞大而复杂的动态时空网络。从死后转向活体，从静态转向动态，从平面转向立体，从单细胞行为转向多细胞通讯是未来的研究趋势。2PLSM是一个强大的活体研究工具。吴璇为论文的第一作者，聂昊和唐洲平教授为论文的并列通讯作者。

IS后，多种损伤机制共同发挥作用，除开重要的神经元组分的细胞死亡外，神经支持系统也发挥了重要作用。只观测脑卒中后单一神经元及神经元环路的变化，而不考虑主要以血管、星形胶质细胞和小胶质细胞为代表的神经支持系统，无法全面阐述IS后的病理生理过程[10-17]。神经支持系统组成了庞大、精密的分级动态网络结构，IS后的动态和精细变化的直接和可靠信息只能在活体大脑中得到呈现，死后动物研究不可避免损失急性期的相关信息，难以重建IS后的脑组织的功能信息，而神经影像学研究的分辨率有限，无法达到细胞层面的分辨率[14, 18-21]。2PLSM作为新兴活组织研究工具，在IS中得到了广泛应用。在讨论和总结了过去几十年来利用2PLSM对IS后活脑组织中支持系统变化及其对神经元命运影响的相关研究后，作者发现，在研究脑支持系统在IS中的作用时，需要充分认识到它们构成了一个动态时空网络，其结构层次、行为和功能状态随环境和时间的变动而动态变化，不同时空节点上的同一细胞成分可能具有不同的功能，对IS后神经元的命运及患者预后有不同影响。

在针对血管的不同层次进行精准栓塞后，研究发现，IS后不同时间、血管的不同层次，对梗死存在不同的反应，其主导的细胞也存在差异（血管分层结构见图1A）。闭塞皮层表面动脉网络后，周围皮层表面动脉网络可实现快速代偿，无神经元损伤。而在闭塞连接表面血管网络和表面下微循环网络的穿透性动脉后，附近的穿透性动脉和皮层表面动脉没有扩张，闭塞的穿透性动脉未恢复血流。血管壁细胞被认为是调控穿通小动脉与毛细血管前括约肌的重要组分（图1E和F），而星形胶质细胞主要调控毛细血管。IS再灌注期的“non reflow phenomenon”很可能与中性粒细胞的渗入、阻塞毛细血管相关。血流恢复期，当血流动力学和纤维蛋白溶解系统不能清除血栓时，栓子外渗是一种替代性再通机制，由一种新的微血管可塑性机制介导（图1G）。星形胶质细胞在IS后存在双相反应。在IS后急性期，星形胶质细胞中钙信号被认为在体内介导神经元损伤，抑制其钙波可减少梗死面积（图2A）。而星形胶质细胞也能调节血流动力学，其调节作用与血管层次密切相关，能调节毛细血管直径，但不能调节小动脉。在IS后恢复期，星形胶质细胞被认为可介导血管新生，并促进神经元重塑（图2C）。小胶质细胞被认为在IS后急性期通过P2Y12受体介导的小胶质细胞-神经元连接发挥神经保护作用（图3A）。但是，支持系统中各组分在IS中的不同时空中的具体作用仍存在争议，作者认为这种现象是由于不同亚群的胶质细胞和不同层次的血管网络在生理和病理环境下存在不同反应，仅敲除或过表达某种基因，仅在一定时间内对神经血管单元中的部分细胞进行成像，只能代表某几种细胞功能的几个方面。并且，采用急性活脑组织切片或活体动物研究，以及IS模型的选择，对实验结果都可能造成影响。因此，在进行研究时，有必要强调该研究中某一组分在脑网络结构中的时空地位和病理生理环境信息。明确IS后的级联损伤过程与脑组织的修复过程的重要参与者、不同细胞群体的激活顺序和功能作用，对深入剖析IS后的病理生理过程、探究治疗靶点十分重要。这个问题在大多数研究中被部分忽视，但正逐渐被认识到[14]。

尽管与神经影像学相比，成像深度有局限性，但2PLSM对于在活体大脑中以亚细胞分辨率同时记录多个细胞和多种细胞类型的结构和功能信息的能力是非常宝贵的。基于2PLSM系统的结果仍然因不同的研究方式而不同。选用体内动物模型或活体脑片、选择年轻动物或年老动物、细胞组分的不同荧光标记方法以及IS的不同建模方法都会使结果偏离自然疾病状态，这对临床转化是一个障碍。此外，将2PLSM提供的高质量细胞水平的体内证据与生化技术提供的分子水平证据联系起来是一个挑战。依靠细胞的特异性消融或特定基因的敲除或上调可能不能完美地融合两者的优势。新兴的空间转录组学技术给这两类技术的融合提供了可能，但繁琐的数据分析处理和解释过程并不友好。

图1 通过双光子激发的荧光激光扫描显微镜（2PLSM）观察到的血管结构。

（图源：Wu,et al., Neural Regen Res, 2023）

图2 来自双光子激发荧光激光扫描显微镜（2PLSM）观察到的星形胶质细胞。

（图源：Wu,et al., Neural Regen Res, 2023）

图3 来自体内双光子激发的荧光激光扫描显微镜（2PLSM）观察小胶质细胞的图像。

（图源：Wu,et al., Neural Regen Res, 2023）

总体而言，该综述以支持系统的分级网络结构为中心出发，总结了以新兴的活体组织研究手段2PLSM为主要研究工具，对IS后脑支持系统网络结构中不同时空组分的具体作用及其对神经元命运影响的研究。此项综述强调了在IS研究中进行活体观测研究及明确研究中脑网络结构时空分级的重要性，为深入探讨IS的病理生理机制及精准治疗提供理论基础。#br# 当然，该综述也存在一定局限性。首先，应该考虑纳入IS后有关神经元变化及神经环路变化的文章，以更好强调神经血管单元及脑组织网络结构的整体性观点，脑组织的正常运转需要所有种类的脑细胞协调合作。其次，论文的结构及论文图片的排版应该更加细致，以说明在IS研究中进行活体研究并明确研究的是哪一脑网络结构的时空节点的重要性。

原文链接：https://doi.org/10.4103/1673-5374.369099

参考文献

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第一作者：吴璇

并列通讯作者：聂昊

并列通讯作者：唐洲平

第一作者：吴璇，女，汉族，学士，华中科技大学同济医学院附属同济医院临床医学八年制在读。#br# 并列通讯作者：聂昊，女，汉族，医学博士，华中科技大学同济医学院附属同济医院老年医学科，主要研究方向为血管老化与抗衰老，主持国家自然科学基金项目1项，湖北省自然科学仅仅项目1项，参与国家重点研发计划项目等多项。#br# 并列通讯作者：唐洲平，男，汉族，医学博士，华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科主任医师，二级教授，华中科技大学同济医学院附属同济医院副院长，在脑出血研究领域处于国内领先地位。主持基金项目共19项，主要研究方向为脑血管病、微创术和干细胞。发表相关科研论文200余篇，总影响因子超过120。