非CpG甲基化降低是脊髓损伤后重要的表观遗传靶点

doi:10.4103/1673-5374.371399

摘要/Abstract

摘要：

DNA甲基化是疾病发生发展的重要表观遗传调节因子；DNA甲基化调控已被证明与多种脊髓损伤相关的功能反应密切相关。为了解DNA甲基化在脊髓损伤中的作用，实验构建了小鼠脊髓损伤后0-42d的连续简并代表性亚硫酸氢盐序列文库（RRBS）。发现脊髓损伤后， DNA甲基化水平整体降低，尤其是非CpG类。基于整体DNA甲基化模式的相似性和层次聚类，使用分层聚类方法可将脊髓损伤分为3个阶段，第0-3天、第7-14 天、第28-42天，分别代表了脊髓损伤的早中晚期。非CpG甲基化尽管占总甲基化丰度的比例很小，但其水平，包括CHG和CHH甲基化水平，显著降低。启动子区、5'非翻译区、外显子、内含子和3'非翻译区中的非CpG甲基化水平均显著下降，而CpG甲基化水平几乎没有改变。约一半的差异甲基化区位于基因间区，CpG和非CpG区的其他差异甲基化主要聚集在内含子区中，且其中DNA甲基化水平最高。接下来分析了启动子区与差异甲基化区相关基因的功能。根据基因本体分析的结果，DNA甲基化与脊髓损伤的多项基本功能反应有关，包括神经元突触连接建立和轴突再生。令人惊讶的是，CpG甲基化和非CpG甲基化均与胶质细胞或炎性细胞功能反应无关。综上，此次实验得到了脊髓损伤后DNA甲基化的动态模式，并发现非CPG甲基化降低是小鼠脊髓损伤后重要的表观遗传靶点。

https://orcid.org/0000-0001-9494-8211 (Liming Cheng)

Abstract: DNA methylation is a critical epigenetic regulator in the occurrence and development of diseases and is closely related to various functional responses in relation to spinal cord injury. To investigate the role of DNA methylation in spinal cord injury, we constructed a library with reduced-representation bisulfite sequencing data obtained at various time points (day 0–42) after spinal cord injury in mice. Global DNA methylation levels, specifically non-CpG (CHG and CHH) methylation levels, decreased modestly following spinal cord injury. Stages post-spinal cord injury were classified as early (day 0–3), intermediate (day 7–14), and late (day 28–42) based on similarity and hierarchical clustering of global DNA methylation patterns. The non-CpG methylation level, which included CHG and CHH methylation levels, was markedly reduced despite accounting for a minor proportion of total methylation abundance. At multiple genomic sites, including the 5′ untranslated regions, promoter, exon, intron, and 3′ untranslated regions, the non-CpG methylation level was markedly decreased following spinal cord injury, whereas the CpG methylation level remained unchanged at these locations. Approximately one-half of the differentially methylated regions were located in intergenic areas; the other differentially methylated regions in both CpG and non-CpG regions were clustered in intron regions, where the DNA methylation level was highest. The function of genes associated with differentially methylated regions in promoter regions was also investigated. From Gene Ontology analysis results, DNA methylation was implicated in a number of essential functional responses to spinal cord injury, including neuronal synaptic connection creation and axon regeneration. Notably, neither CpG methylation nor non-CpG methylation was implicated in the functional response of glial or inflammatory cells. In summary, our work elucidated the dynamic pattern of DNA methylation in the spinal cord following injury and identified reduced non-CpG methylation as an epigenetic target after spinal cord injury in mice.

Key words: CpG methylation, cytosine fraction, differentially methylated regions, DNA methylation, DNA methyltransferases, dynamic signatures, Gene Ontology, non-CpG methylation, single-cell RNA-Seq, spinal cord injury

. 非CpG甲基化降低是脊髓损伤后重要的表观遗传靶点[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2023, 18(11): 2489-2496.

Zhourui Wu, Chen Li, Ran Zhu, Yiqiu Cao, Thomas C. Chen, Liming Cheng. Reduced non-CpG methylation is a potential epigenetic target after spinal cord injury[J]. Neural Regeneration Research, 2023, 18(11): 2489-2496.

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引言

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延伸阅读

NRR：同济大学附属同济医院程黎明团队发现非CPG甲基化降低是脊髓损伤后重要的表观遗传靶点

撰文：吴周睿，李琛，祝然，程黎明

脊髓损伤是一种椎管内神经组织的急性创伤性损伤，可产生多种神经问题，如感觉和运动反应功能障碍。然而，脊髓损伤后原发性和继发性损伤的主要分子功能过程仍不清楚。既往对脊髓损伤的转录组研究结果表明，基因表达模式随着时间的推移而变化[1]。除转录分析外，表观遗传分析，如微小RNA高通量测序也逐渐引起重视[2]。然而，只有少数研究探索了脊髓损伤后DNA甲基化状态的变化[3-5]。近年来，对脑发育过程中DNA甲基化模式的深入研究表明，DNA甲基化存在于特定的基因组区域，尤其是与染色质开放获取相关的区域，因此对转录启动至关重要，可导致发育过程中转录组的改变。DNA甲基化调控已被证明与多种脊髓损伤相关的功能反应密切相关。如DNA甲基化与神经元死亡有关[6]，并能调控神经元轴突再生和生长锥发育[7]，还可参与神经胶质细胞分化和命运的决定[8]，以及促进炎症反应和激活[9]和血管生成[10]。因此，脊髓损伤后DNA甲基化状态的改变必须被认为是一个重要的调控因素。此外，解析脊髓损伤后功能反应的时序性也需要深入了解DNA甲基化改变的时间规律。

最近，中国同济大学附属同济医院程黎明团队在《中国神经再生研究（英文版）》（Neural Regeneration Research）上发表了题为“Reduced non-CpG methylation is a potential epigenetic target after spinal cord injury”的研究，发现脊髓损伤后DNA甲基化的整体降低，尤其是非CpG类。此外，DNA甲基化鉴定的脊髓损伤后功能时间窗结果与既往RNA测序的结果一致，强调了其在脊髓损伤中的重要作用。DNA甲基化与多梳家族(Polycomb group，PcG)共同参与转录调控，并主要靶向与再生相关的过程，如轴突发生和组织发育与再生。这一研究揭示，非CPG甲基化降低是小鼠脊髓损伤后重要的表观遗传靶点，可通过调控脊髓损伤后再生事件发挥重要的转录调控作用。

程黎明等建立了小鼠T9脊髓损伤的简化基因组甲基化测序（RRBS）库，并得出重要的发现（图1）。首先，脊髓损伤后DNA甲基化水平降低，大部分下降在非CpG甲基化区域。然后，利用层次聚类和主成分分析，确定甲基化相关疾病的时间窗口，发现第0-3天代表早期，第7-14天代表中期，第28-42天代表晚期。此外，甲基化损失在中期最为显著，而早期和晚期的低甲基化水平相似。对不同基因组区域的分析表明，DNA甲基化主要集中在基因间区域。正如预期的那样，转录起始位点的CpG甲基化缺失。此外，内含子中CHG和CHH甲基化水平明显高于其他区域。脊髓损伤后基线CpG和CHH甲基化水平增加，而CHG甲基化水平没有模型变化。与假手术组相比，脊髓损伤组中多个基因区域中CpG甲基化水平几乎没有改变。相比之下，启动子区、5'非翻译区、外显子、内含子和3'非翻译区中的CHG和CHH甲基化水平均显著下降。

图1甲基化胞嘧啶在小鼠脊髓损伤后CG和非CG环境中是动态且丰富的（图源：Wu et al., Neural Regen Res, 2023）

另外，研究还关注于基因启动子区域中DNA甲基化的改变，鉴定出由于脊髓损伤而导致的高甲基化或低甲基化的基因，并对进行聚类和功能注释。DNA甲基化标记是中枢神经系统中的主要表观遗传调节因子，程黎明等揭示了脊髓损伤后每个阶段的特点（图2）。CpG甲基化显示出明确的阶段特异性聚类。基于CpG和非CpG甲基化之间的簇差异，使用分层聚类方法可将脊髓损伤分为3组。第1组包含第0，1和3天，第2组包括第7和14 天，第3组包括第28和42天，这3组分别代表了脊髓损伤的早中晚期。此外，每个组之间的距离显示了明确的时间特性。接下来根据3个损伤阶段重新评估DNA甲基化水平，发现非CpG甲基化是甲基化下降的主力。

图2 CpG甲基化模式决定了脊髓损伤后的功能分期（图源：Wu et al., Neural Regen Res, 2023）

紧接着，研究使用SeqMonk及其注释数据库来研究差异甲基化区在不同基因组元件中的行为，以全面了解其的变化（图3）。结果发现，非CpG，而不是CpG的差异甲基化区发生了显著的改变，与既往研究一致，非CpG区的绝对甲基化水平远低于CpG区。CpG和非CpG的差异甲基化区在脊髓损伤后早期和中期呈现出低甲基化状态。第14天后，甲基化水平逐渐恢复，但与假手术组仍有相当程度差距。为阐明每个时间点DNA甲基化的功能过程，对不同时间点对启动子差异甲基化区簇进行了基因本体（GO）分析，结果发现CpG甲基化主要参与早期和晚期的神经发生相关调节机制。

图3脊髓损伤后不同时间时CpG、CHG和CHH背景下差异甲基化区的变化（图源：Wu et al., Neural Regen Res, 2023）

既往研究认为，基因DNA甲基化对哺乳动物中枢神经系统的发育、成熟和疾病发病具有深远影响，其与转录直接相关[11]。为更好地了解脊髓损伤后DNA甲基化和基因表达调控的机制，程黎明等对损伤后脊髓环境和区域的DNA甲基化和基因表达水平进行了Pearson相关分析（图4）（使用的基因表达数据是从既往研究中收集的[1]）。关于CpG甲基化，启动子和内含子甲基化水平与基因表达水平呈负相关，但外显子CpG甲基化水平与基因转录水平无关。而CHG和CHH甲基化水平与启动子、外显子和内含子中的基因转录水平均呈负相关。此外，启动子中DNA甲基化与不同时间间隔的基因转录之间存在负相关。CpG和CH簇1和2以中等水平表达，其甲基化水平大于其他簇。簇5和6表现出相反的模式，具有更高的基因表达水平，但较低的DNA甲基化水平。尽管脊髓损伤后15 min内（第0天）基因转录的累积改变不明显，但与假手术组相比，DNA甲基化，特别是CHG和CHH甲基化均发生了显著的变化。检查脊髓损伤的早期和中期阶段，可发现转录上调基因中的DNA甲基化水平均出现下降。

图4 脊髓损伤中DNA甲基化与基因转录的相关性（图源：Wu et al., Neural Regen Res, 2023）

综上，从脊髓损伤的早期到晚期，DNA甲基化与神经元/轴突再生、突触形成、离子通道、囊泡转运、微管形成和神经回路投射构建有关。多个神经发育信号通路，包括WNT、转化生长因子和胰岛素样生长因子通路，都依赖于DNA甲基化。DNA甲基化对于通过蛋白质修饰系统介导的下游过程也至关重要，如磷酸化、泛素化、糖基化和其他修饰，以及Ras、MAPK、PI3K-AKT和Hippo通路，表明其在蛋白质成熟、激活、失活和降解中均起着至关重要的作用。DNA甲基化标记可与其他表观遗传改变标记相互作用，主要是组蛋白修饰标记，表明脊髓损伤后DNA甲基化对基因转录的控制涉及与其他表观遗传过程的协同作用。DNA甲基化参与调控转录复合物相关过程，特别是那些涉及PcG家族转录因子的过程，对基因转录至关重要。因此这一研究详细描述了DNA甲基化所起的作用以及脊髓损伤过程中这种修饰的动态特征。

然而，仍存在一些问题无法通过RRBS技术来回答，RRBS是基于甲基化敏感的限制性内切酶（Msp1），其富集了基因组周围CCGG含量的胞嘧啶甲基化，但含有CpG识别位点的数量太少，基因组覆盖率低。另外其不能用于区分由TET蛋白家族成员介导的甲基化胞嘧啶（5mC）和羟甲基化胞嘧啶（5hmC）。全基因组甲基化测序（WGBS）为研究CpG岛以外的感兴趣区域提供了思路，氧化亚硫酸氢盐测序（oxBS-Seq）揭示5hmC修饰模式也将是个有趣的研究方向。此外，单细胞RRBS或带流式细胞术的RRBS可进一步研究DNA甲基化如何调节不同细胞类型中的基因转录的详细信息。

原文链接：https://doi.org/10.4103/1673-5374.371399

参考文献

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[9] Celarain N, Tomas-Roig J. Aberrant DNA methylation profile exacerbates inflammation and neurodegeneration in multiple sclerosis patients. J Neuroinflammation. 2020;17(1):21.

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[11] Moore LD, Le T, Fan G. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacology. 2013;38(1):23-38.

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通讯作者：程黎明，主任医师，教授，博士生导师。同济大学附属同济医院骨科学科带头人，脊柱脊髓损伤再生修复教育部重点实验室主任、上海市重中之重重点学科骨外科带头人、上海市重点专科脊柱外科带头人、国家万人计划科技创新领军人才、国家重点研发计划首席科学家、国家百千万人才工程人选、国家有突出贡献中青年专家、国家特殊津贴获得者、上海领军人才、上海市科技精英、上海医学发展杰出贡献奖获得者、上海市先进工作者。同时担任世界神经修复学会（IANR）理事、中国研究型医院神经转化研究专委会副主任委员、上海市医师协会骨科医师分会副会长等。

程黎明教授临床主攻脊柱脊髓损伤的再生修复、脊柱退变性疾病的微创化治疗以及脊柱外科疑难杂症的诊治与康复，并率先提出了“早期损伤控制、全过程康复”的脊髓损伤救治策略，组建了“外科-康复-生物一体化”团队，主持国家重点研发计划、国家自然科学基金重点项目等20余项。发表论文百余篇，其中Cell、Nature Medicine、Advanced Materials等SCI、EI收录论文60余篇；中华核心期刊30余篇。主编著作3部；获批专利17项，其中发明专利11项；获中国康复医学会科学技术奖一等奖、上海市康复医学会科学技术奖一等奖、华夏医学科技奖一等奖、上海市科技进步奖一等奖、上海市科技进步奖推广奖等省部级奖励10余项。