NRR：山西大同大学刘春云和马存根团队报道Fasudil修饰的巨噬细胞极化可作为治疗多发性硬化的细胞新疗法
撰文：刘春云，郭尚德，刘蓉，郭敏芳，王青，柴智，肖保国，马存根
实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的，以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，其病理变化与多发性硬化（multiple sclerosis，MS）类似。由于MS样本不易获取，因此EAE动物模型是研究MS病理过程、发病机制的重要途经，在临床神经免疫学的研究中具有重要意义。
巨噬细胞作为外周免疫系统重要的抗原递呈细胞，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的疾病诱发和进展中起重要作用。巨噬细胞具有很强的功能可塑性，病理条件下不同极化的巨噬细胞既可以是EAE疾病过程中的炎性致病因素，又可作为组织损伤的修复者，其看似矛盾的特性，反应了不同微环境下表型和功能的转化[1]。近年来，细胞免疫疗法成为神经科学领域研究的热点，有取材简便、易于分离培养、可自体移植、经济安全、无道德伦理问题等优点。Rho激酶（ROCK）作为参与细胞诸多活动的主要激酶之一，被认为是治疗神经系统疾病很有潜力的药物靶点[2,3]。Fasudil作为ROCK抑制剂，具有抑制EAE小鼠Th1、Th17细胞和促炎型M1巨噬细胞，诱导调节性T细胞及抗炎型M2巨噬细胞转化的功能[4]。然而，Fasudil修饰的巨噬细胞极化在EAE疾病的治疗中发挥着怎样的作用，巨噬细胞转化的分子机制如何，以及Fasudil对巨噬细胞靶向信号通路的调控机制仍缺乏深入而全面的总结。
近期，山西大同大学马存根团队在《中国神经再生研究（英文版）》（Neural Regeneration Research）上发表了题为“Fasudil-modified macrophages reduce inflammation and regulate the immune response in experimental autoimmune encephalomyelitis”的研究论文。通过研究，他们发现，腹腔注射Fasudil修饰的巨噬细胞可推迟EAE小鼠发病，减轻临床症状，改善脱髓鞘，减少中枢炎性细胞浸润。Fasudil通过抑制巨噬细胞ROCK-II/p-MYPT1活性、TLRs/MAPK和NF-κB/RPS3信号通路激活及炎性细胞因子产生，促使促炎型M1巨噬细胞向抗炎型M2巨噬细胞转换。该文带来的启示：Fasudil修饰的巨噬细胞极化可作为治疗EAE疾病的细胞新疗法。刘春云为第一作者，马存根教授为通讯作者。
研究者首先观察Fasudil修饰的巨噬细胞治疗EAE的临床效果。MOG35-55多肽诱导建立EAE模型，免疫后第3天和第11天腹腔注射2×107 Fasudil或PBS修饰的巨噬细胞（macrophages，Mφ）。结果显示，PBS-Mφ组小鼠于免疫后第11天起相继发病，平均起病发病时间为12.08±1.78天，其发病率达100%，平均最高评分为3.67±0.91。与PBS-Mφ组相比，Fasudil-Mφ组小鼠起病较晚（15.11 ± 2.68），发病率较低（75%），平均最高评分较轻（2.08±1.76）。EAE模型的临床症状曲线清晰地显示比较PBS-Mφ组，Fasudil-Mφ组小鼠临床症状评分明显减轻，且体重丢失较少（图1）。这些结果表明，Fasudil修饰的巨噬细胞可改善EAE小鼠的临床症状。
图1 Fasudil修饰的巨噬细胞可改善EAE小鼠的临床症状
（图源Liu et al., Neural Regen Res, 2024）
EAE是一个中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病，病理学表现为脱髓鞘病变和CNS炎性细胞浸润，因此研究者对各组小鼠行髓鞘染色（LFB染色）和HE染色。HE染色显示，比较PBS-Mφ组小鼠脊髓炎性细胞反应，Fasudil-Mφ组小鼠CNS炎性细胞浸润减少。LFB染色显示，PBS-Mφ组小鼠脊髓白质部分丢失明显，而Fasudil-Mφ组小鼠脊髓髓鞘脱失较轻。外周免疫细胞的中枢浸润在EAE的病理过程中起着重要的作用，我们进一步观察各组小鼠巨噬细胞标志CD68在脊髓组织的表达情况。免疫组化染色显示，PBS-Mφ组小鼠脊髓组织中CD68巨噬细胞表达较多，而Fasudil-Mφ组小鼠CD68巨噬细胞CNS浸润明显减少（图2）。提示Fasudil修饰的巨噬细胞可明显抑制EAE小鼠CNS炎性细胞浸润，减少由此引起的炎症反应。
图2 Fasudil修饰的巨噬细胞可减轻脊髓炎性细胞浸润，抑制脱髓鞘
（图源Liu et al., Neural Regen Res, 2024）
大量研究证明，EAE的致病效应细胞主要是Th1和Th17 T细胞，前者主要分泌IFN-γ，而后者主要分泌IL-17。同时，Th2 T细胞作为免疫调节细胞或抑制性T细胞，具有免疫调节和抗炎作用。为了解Fasudil修饰的巨噬细胞对外周免疫系统的免疫调节和抗炎的作用，我们取免疫后第28天（d 28 p.i.）小鼠脾脏制备单个核细胞（MNCs），应用流式细胞术（FACS）检测CD4+ IFN-γ、IL-17和IL-10水平。结果显示（图3），Fasudil修饰的巨噬细胞可减少IL-17的CD4+T细胞比例，并增强IL-10的CD4+T细胞水平。
图3 Fasudil修饰的巨噬细胞影响EAE小鼠外周免疫系统T细胞极化
（图源Liu et al., Neural Regen Res, 2024）
巨噬细胞根据功能状态不同分为促炎M1型和抗炎M2型。促炎M1型即为经典激活型，一般表达高氧化应激产物和促炎性因子，引起组织的炎性损伤；抗炎M2型即为选择性激活型，具有抑制免疫炎症反应和促进组织修复的作用。M1型主要表达iNOS、IL-12、CD16/32等，而M2型主要表达Arg-1、IL-10等。应用FACS于d 28 p.i.分析Fasudil修饰的巨噬细胞对脾脏M1型巨噬细胞亚型CD16/32、iNOS、IL-12和M2型巨噬细胞亚型CD206、Arg-1、IL-10的F4/80细胞表达。结果显示（图4），Fasudil修饰的巨噬细胞抑制CD16/32、IL-12、iNOS水平，增强CD206、Arg-1、IL-10表达。上述结果表明，Fasudil修饰的巨噬细胞可部分逆转T细胞和巨噬细胞表型，即Th17、M1型表达降低，而Th2、M2型表达增高。
图4 Fasudil修饰的巨噬细胞影响EAE小鼠外周免疫系统巨噬细胞极化
（图源Liu et al., Neural Regen Res, 2024）
基于Fasudil修饰的巨噬细胞对EAE小鼠的治疗作用，我们进一步探讨免疫治疗的机制。MOG35-55诱导建立EAE模型，d 9 p.i.磁珠分选致脑炎性巨噬细胞，与Fasudil/PBS共培养72小时，FACS检测Fasudil对巨噬细胞亚型变化的影响。Rho激酶（ROCK）是近年来发现参与EAE发病的重要激酶之一，磷酸化的肌球蛋白磷脂酶-靶向亚基1（p-MYPT1）是ROCK作用的底物，是另一个显示ROCK活性的指标，我们采用Western blot技术检测PBS或Fasudil修饰的巨噬细胞的ROCK-II和p-MYPT1蛋白表达水平。结果显示（图5），致炎性巨噬细胞p-MYPT1和ROCK-II活性增强，Fasudil可以抑制巨噬细胞ROCK-II和p-MYPT1的表达。
图5 Fasudil在体外抑制巨噬细胞的ROCK活性
（图源Liu et al., Neural Regen Res, 2024）
MOG35-55诱导建立EAE模型，d 9 p.i.磁珠分选致脑炎性巨噬细胞，与Fasudil/PBS共培养72小时，FACS检测Fasudil对巨噬细胞亚型变化的影响。结果显示，巨噬细胞M1表型（即M1型标志CD16/32、iNOS、IL-12、CD40）较高，M2表型（M2型标志CD206、IL-10、Arg-1、CD14）减低。Fasudil可部分逆转M1表型至M2表型（即M1型标志CD16/32、iNOS、IL-12降低而M2型标志CD206、IL-10、Arg-1、CD14增加）（图6）。
图6 Fasudil驱动促炎M1型巨噬细胞向抗炎M2型巨噬细胞转化
（图源Liu et al., Neural Regen Res, 2024）
我们采用Western blot技术，进一步定量分析Fasudil对巨噬细胞的调节作用。图7显示，Fasudil处理则可以明显抑制iNOS表达，增加Arg-1水平。我们继续使用Greeis试剂检测氧化产物NO水平，同时用ELISA试剂盒测定Arginase的酶活性。结果显示，Fasudil处理则可显著抑制致炎性巨噬细胞产生NO，同时明显增加Arg-1的酶活性。总而言之，我们采用不同的技术确认了Fasudil可部分逆转促炎M1型巨噬细胞至抗炎M2型巨噬细胞，不仅表现为蛋白表达，而且可以影响其生物活性分子和酶活力。
图7 Fasudil对巨噬细胞iNOS/NO和Arg-1极化的影响
（图源Liu et al., Neural Regen Res, 2024）
TLRs通过Myd88依赖性/非依赖性信号通路对EAE的炎症易感性起重要作用。我们首先观察Fasudil对TLRds-Myd88通路的影响。结果显示，致炎性巨噬细胞TLR-4/2和Myd88的表达明显增加，Fasudil可效抑制巨噬细胞TLR-4和Myd88蛋白的表达（图8A）。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是TLRds-Myd88信号通路的下游分子，我们采用Western blot技术测定巨噬细胞P38、ERK、JNK的水平。结果显示，致炎性巨噬细胞P38、ERK、JNK的表达增加，Fasudil可效抑制巨噬细胞P38、JNK的表达，但对p-ERK活性无影响（图8B）。我们的数据显示，Fasudil影响巨噬细胞炎症反应的初始靶点是TLR4及其下游分子MyD88及MAPK。
图8 Fasudil影响巨噬细胞中的TLRs/Myd88/MAPK信号通路
（图源Liu et al., Neural Regen Res, 2024）
我们知道神经炎症会增强EAE的发生率。p-NF-κB是一种重要的转录因子，参与免疫反应，介导炎症因子的产生。我们采用western blot技术检测巨噬细胞p-NF-κB和RPS3蛋白的表达，并使用ELISA法检测巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α细胞因子的分泌。如图9所示，巨噬细胞p-NF-κB、RPS3、IL-1β、IL-6和TNF-α表达上调。Fasudil显著抑制p-NF-κB、RPS3的表达和IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌。上述结果显示，Fasudil可抑制巨噬细胞介导的炎症介质的释放。
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图9 Fasudil影响巨噬细胞的炎症反应
（图源Liu et al., Neural Regen Res, 2024）
综上所述，研究者的数据表明，Fasudil修饰的巨噬细胞对EAE有较好的治疗效果，可以改善临床症状，减轻髓鞘的脱失和抑制炎症反应。Fasudil通过抑制巨噬细胞ROCK-II/p-MYPT1活性、TLRs/MAPK和NF-κB/RPS3信号通路激活及炎性细胞因子产生，促使促炎型M1巨噬细胞向抗炎型M2巨噬细胞转换。此项研究结果提示免疫细胞疗法可作为一种新的治疗EAE的策略。
当然该研究也存在一定性局限性。首先，缺乏PBS/Fasudil修饰的巨噬细胞腹腔注射后体内示踪的数据。第二，没有RNA-seq的研究结果来全面确定PBS/Fasudil修饰巨噬细胞的极化状态。第三，探讨中枢神经系统病理变化时，缺乏免疫荧光双染色对CD68+巨噬细胞与促炎M1亚型或抗炎M2亚型的定量分析结果。这些局限性需要在未来的研究中加以解决。
原文链接：https://doi.org/10.4103/1673-5374.379050
参考文献
[1]Zhang HF, Li YH, Yu JZ, et al. Rho kinase inhibitor fasudil regulates microglia polarization and function. Neuroimmunomodulation. 2013;20(6):313-322.
[2]Liu CY, Guo SD, Yu JZ, et al. Fasudil mediates cell therapy of EAE by immunomodulating encephalomyelitic T cells and macrophages. Eur J Immunol. 2015;45(1):142-152.
[3]Guo SD, Liu CY, Yu JW, et al. Nasal delivery of Fasudil-cocultured immune cells exhibits therapeutic potential in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurosci Ther. 2019;25(6):783-795.
[4]Liu CY, Li YH, Yu JZ, et al. Targeting the shift from M1 to M2 macrophages in experimental autoimmune encephalomyelitis mice treated with fasudil. PLoS One. 2013;8(2):e54841.
第一作者介绍：刘春云，副教授，毕业于山西医科大学，研究方向神经免疫。主持国家自然科学基金、山西省基础研究、大同市基础研究项目各1项；以第一作者发表论文10篇，其中SCI论文4篇；获山西省科技进步二等奖1。
通讯作者介绍：马存根，国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室主任、基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室主任、国家中医药管理局“十二五”中医药重点学科—中西医结合基础学科带头人，国务院政府经贴专家，山西省委联系高级专家，山西省高等学校教学名师。主持国家自然科学基金3项和10余项省级项目，发表论文280余篇，其中被SCI收录80余篇。获山西省科技进步二等奖、三等奖各3项。
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研究团队合影
