ATP1A1基因突变致2型腓骨肌萎缩和难治性癫痫发作的果蝇模型

doi:10.4103/1673-5374.391302

摘要/Abstract

摘要：

人Na⁺/K⁺-ATP 酶亚基ATP1A1中的某些氨基酸突变会导致2型腓骨肌萎缩和难治性癫痫发作。为研究Na⁺/K⁺-ATP 酶在这些疾病中的作用，实验拟编辑Atpα（人ATP1A1的果蝇同源物）的基因以建立果蝇模型。首先使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术位于人ATP1A1螺旋连接区内的I592T，A597T，P600T和D601F对应的突变同时引入果蝇Atpα基因中，生成Atpα^TTTF果蝇；并采用相同的策略来生成单点突变的果蝇（Atpα^I571T，Atpα^A576T，Atpα^P579T和Atpα^D580F）。另外，还获得了1种缺失突变等位基因（Atpα^mut）。在这些等位基因中，存在2种由纯合维持的等位基因（Atpα^I571T和Atpα^P579T），另4种（Atpα^TTTF/+，Atpα^A576T/+，Atpα^D580F/+和Atpα^mut/+）只能与Atpαmut形成杂合子维持。进一步观察发现，携带这些突变Atpα等位基因在果蝇中表现出不同的表型，其中Atpα^TTTF杂合突变的果蝇具有运动性能障碍和寿命缩短的表现，且也存在癫痫发作和异常神经元形态。实验构建的果蝇模型将为研究钠钾泵功能和调节提供新平台。

https://orcid.org/0000-0001-5259-7214 (Wenfeng Chen); https://orcid.org/0000-0002-7383-9128 (Xinrui Wang)

关键词: Atpα, ATP1A1, Na⁺/K⁺-ATP 酶, 钠钾泵, 2型腓骨肌萎缩, CRISPR/Cas9, 点突变, 同源定向修复, 爆炸性麻痹, 癫痫发作

Abstract: Certain amino acids changes in the human Na+/K+-ATPase pump, ATPase Na+/K+ transporting subunit alpha 1 (ATP1A1), cause Charcot-Marie-Tooth disease type 2 (CMT2) disease and refractory seizures. To develop in vivo models to study the role of Na+/K+-ATPase in these diseases, we modified the Drosophila gene homolog, Atpα, to mimic the human ATP1A1 gene mutations that cause CMT2. Mutations located within the helical linker region of human ATP1A1 (I592T, A597T, P600T, and D601F) were simultaneously introduced into endogenous Drosophila Atpα by CRISPR/Cas9-mediated genome editing, generating the AtpαTTTF model. In addition, the same strategy was used to generate the corresponding single point mutations in flies (AtpαI571T, AtpαA576T, AtpαP579T, and AtpαD580F). Moreover, a deletion mutation (Atpαmut) that causes premature termination of translation was generated as a positive control. Of these alleles, we found two that could be maintained as homozygotes (AtpαI571T and AtpαP579T). Three alleles (AtpαA576T, AtpαP579 and AtpαD580F) can form heterozygotes with the Atpαmut allele. We found that the Atpα allele carrying these CMT2-associated mutations showed differential phenotypes in Drosophila. Flies heterozygous for AtpαTTTF mutations have motor performance defects, a reduced lifespan, seizures, and an abnormal neuronal morphology. These Drosophila models will provide a new platform for studying the function and regulation of the sodium-potassium pump.

Key words: ATP1A1, Atpα, bang-sensitive paralysis, Charcot-Marie-Tooth disease type 2, CRISPR/Cas9, homology-directed repair, Na⁺/K⁺-ATPase, point mutation, seizures, sodium pump

. ATP1A1基因突变致2型腓骨肌萎缩和难治性癫痫发作的果蝇模型[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2025, 20(1): 265-276.

Yao Yuan, Lingqi Yu, Xudong Zhuang, Dongjing Wen, Jin He, Jingmei Hong, Jiayu Xie, Shengan Ling, Xiaoyue Du, Wenfeng Chen, Xinrui Wang. Drosophila models used to simulate human ATP1A1 gene mutations that cause Charcot-Marie-Tooth type 2 disease and refractory seizures[J]. Neural Regeneration Research, 2025, 20(1): 265-276.

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延伸阅读

NRR：福州大学陈文锋和福建省妇幼保健院王心睿团队成功构建2型腓骨肌萎缩和癫痫果蝇模型

撰文：陈文锋

钠钾泵，又称Na⁺/K⁺-ATP 酶，是一种在所有动物细胞膜中均有发现的电跨膜ATP酶，可在生理学中执行多种功能。钠钾泵对于兴奋性细胞，如对刺激做出反应并传递脉冲的神经细胞，尤其重要^[1]。钠钾泵功能障碍可导致多种疾病，如肾上腺高血压、癫痫和神经变性^[2-4]。腓骨肌萎缩是一组遗传性神经系统疾病，约每2500人中就有1人受到影响；患者可见周围神经损伤^[5]。已报道了组成钠钾泵的重要亚基ATP1A1中的某些氨基酸突变可导致2型腓骨肌萎缩(CMT2)和难治性癫痫发作^[6-8]。但是尚未建立合适的模拟ATP1A1基因突变的动物模型用于致病机制的研究。

最近中国福州大学陈文锋和福建省妇幼保健院王心睿团队在《中国神经再生研究（英文版）》（Neural Regeneration Research）上发表了题为“Drosophila models used to simulate human ATP1A1 gene mutations that cause Charcot-Marie-Tooth type 2 disease and refractory seizures”的研究，以基因编辑手段修改编码Atpα（人ATP1A1的果蝇同源物）的基因，开发了果蝇CMT2模型。当果蝇Atpα发生与人类CMT2相应突变时，部分果蝇可表现出明显的运动性能缺陷、神经元形态异常和寿命缩短，以及一些模仿经典CMT2和癫痫样发作特征的表型。这些CMT2模型将为研究钠钾泵功能和调节提供新的途径，也将为研究CMT2和相关癫痫病的发病机制和潜在治疗提供平台。

为检查人ATP1A1突变引起的致病性是否可以在果蝇中重现，陈文锋和王心睿等首先评估了人ATP1A1 与其在果蝇中的同源物Atpα的相似性，得出两者在蛋白质序列水平的总体同一性约为80%（图1）。ATP1A1中8种^{[6, 8]}与CTM2相关的残基中的6种在果蝇Atpα中保守（p.I592、p.A597、p.P600，p.D601，p.D811和p.G877）（图1）。接下来使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将I592T(dI571T)，A597T(dA576T)，P600T(dP579T)和D601F(dD580F)对应的突变同时引入果蝇Atpα基因中（图1）。将这个同时包含4种点突变I571T，A576T，P579T和D580F的模型命名为Atpα^TTTF。此外，采用相同的策略来生成单点突变果蝇（Atpα^I571T，Atpα^A576T，Atpα^P579T和Atpα^D580F）。另外，还获得了1种缺失突变等位基因（Atpα^mut）。在这些等位基因中存在2种可以是纯合的（Atpα^I571T和Atpα^P579T），另4种（Atpα^TTTF/+，Atpα^A576T/+，Atpα^D580F/+和Atpα^mut/+）只能由杂合子维持。但Atpα^D580F/+的后代中存在纯合个体，而这些纯合个体是不育的。为进一步了解这些等位基因的遗传特征，实验将Atpα^mut/+与其他携带不同等位基因的个体杂交。除Atpα^TTTF和Atpα^I571T外，所有其他等位基因均可与Atpα^mut形成杂合子。这表明ATP1A1对应的CMT2相关突变等位基因可能涉及功能丧失或显性失活，情况可能更加复杂。

此外，陈文锋和王心睿等预测了蛋白质结构，确定这些CMT2相关突变对整体蛋白质结构的影响有限。细胞质区域仍然保留了3个明确的细胞质结构域：A（致动器）、N（核苷酸结合）和 P（磷酸化）结构域（图2）。4种单点突变可导致残基ATP1A1^pI592位置发生了微小结构改变，可将残基从无规则卷曲转变为β-折叠片段（图2）。ATP1A1^TTTF突变不仅改变了ATP1A1^pI592残基的位置，还改变了ATP1A1^pA597残基原来的随机卷曲，使其成为α螺旋的一部分（图2）。

为了研究携带CMT2突变的Atpα的表达是否导致Na⁺失衡，陈文锋和王心睿等使用钠绿探针监测果蝇大脑中Na⁺含量。与对照组相比，携带CMT2突变的Atpα^TTTF等位基因杂合果蝇的全脑细胞内Na⁺含量大约高出2倍（图3）。除Atpα^A576T/+，Atpα^D580F/+和Atpα^mut/+外，所有其他等位基因与对照组相比，全脑细胞内Na⁺含量更高（图3）。此外，作者还发现大多数CMT2果蝇（Atpα^TTTF/+，Atpα^I571T，Atpα^I571T/+，Atpα^A576T/+，Atpα^D580F/+和Atpα^mut/+）的Na⁺/K⁺-ATP酶活性显著降低（图3）。当果蝇用哇巴因（一种钠钾泵抑制剂）处理时，CMT2果蝇对毒素没有抵抗力，表明Atpα中具有CMT2突变的果蝇与具有野生型泵的果蝇一样对哇巴因敏感。

陈文锋和王心睿等还评估了Atpα等位基因突变的果蝇是否存在运动性能缺陷。3和15d龄的Atpα-CMT2 和缺失突变果蝇（Atpα^I571T/+，Atpα^A576T/+，Atpα^P579T/+和Atpα^D580F/+除外）在攀爬测定中均具有显著的运动性能缺陷（图4）。只有Atpα^TTTF/+，Atpα^I571T/+，Atpα^P579T/+和Atpα^mut/+等位基因的果蝇的寿命缩短（图4）。总的来说，这些结果表明携带CMT2突变的Atpα等位基因的表达在果蝇中具有致病性，并且等位基因之间的影响不同。

由于CMT2患者的外周运动和感觉神经元受到影响，陈文锋和王心睿等使进一步确定携带CMT2突变的Atpα等位基因是否导致神经元的形态缺陷。首先评估了神经肌肉接头形态是否受到影响，发现Atpα-CMT2 和缺失突变果蝇中的突触数量明显减少，突触长度也明显缩短（图5）。此外，除了Atpα^D580F/+和Atpα^mut/+外，所有其他杂合Atpα-CMT2果蝇的感觉神经元的树突分支均显著减少（图5）。除Atpα^mut/+外，Atpα-CMT2果蝇中节律神经元回路轴突的复杂性显著降低（图5）。因此，携带CMT2突变的Atpα等位基因的果蝇具有终末轴突变性，再现了CMT2疾病的特征。

据报道，钠钾泵功能的紊乱会导致神经退行性病变^[9]，因此陈文锋和王心睿等使评估具有CMT2相关突变的Atpα表达是否会引发严重的神经缺陷。通过脑细胞凋亡评估神经缺陷表明，带有Atpα^TTTF，Atpα^I571T和Atpα^P579T等位基因的果蝇大脑中细胞凋亡增加（图6）。这些结果表明Atpα^TTTF/+，Atpα^I571T，Atpα^I571T/+和Atpα^P579T CMT2突变导致大脑神经系统缺陷。此前发表的研究表明，中枢神经系统钠钾泵功能受损会导致癫痫发作^[7]。对3和15d龄的Atpα^TTTF/+果蝇进行短暂的机械冲击会导致癫痫样表型，而在对照组中未观察到这种现象（图6）。令人惊讶的是，这种行为在30d的Atpα^TTTF/+果蝇中减弱（图7）。此外，作者测试了其他CMT2果蝇，只发现Atpα^I571T相关果蝇表现出癫痫样表型（图7）。总之，Atpα^TTTF/+果蝇在作者测试的所有表型中均呈阳性，而其他等位基因在多个表型中表现出差异。

综上所述，该研究的CMT2模型将为研究钠钾泵功能和调节提供新方法。了解CMT2相关突变引起的泵功能障碍的分子基础将为进一步研究CMT2和相关癫痫病的发病机制和潜在治疗提供平台。尽管如此，该研究也有一些问题值得关注：虽然果蝇模型提供了有价值的见解，但它们可能无法完全捕捉CMT2和难治性癫痫等人类疾病的复杂性。该研究重点是特定的表型，如运动表现、寿命、癫痫发作和神经元形态。这些表型可能不涵盖CMT2和癫痫发作的全部临床表现。虽然果蝇模型为ATP1A1相关疾病提供了宝贵的见解，但研究人员在解释这些发现并将其应用于人类时应考虑这些局限性。可能需要结合其他因素和不同模型系统进行进一步研究，以全面了解 CMT2、癫痫发作和相关疾病的机制。

参考文献

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