DNA甲基化异常对高炎症状态缺血性脑卒中预后的影响

doi:10.4103/1673-5374.392890

摘要/Abstract

摘要：

炎症与脑卒中的功能预后密切相关，高炎症状态导致脑卒中功能预后不良。DNA 甲基化与中风的发病机制和预后有关。然而，DNA 甲基化对高炎症水平脑卒中的影响尚不清楚。为了探讨低甲基化/高甲基化状态对高炎症脑缺血功能预后的影响，实验建立了大脑中动脉阻塞小鼠模型，并用脂多糖诱导小鼠进入高炎症状态，使用小分子抑制剂抑制关键 DNA 甲基化/去甲基化酶的功能。实验结果显示，在脂多糖诱导的高炎症状态下，DNA 甲基化的抑制可能是脑缺血向严重性发展的原因。通过检测使用抑制剂后外周血中 DNA 5-mc 和 DNA 5-hmc 的水平，证实了全身甲基化状态的变化。随后发现，DNA 甲基化抑制剂治疗导致小鼠高炎症卒中后梗死体积扩大，功能预后恶化。缺血脑组织和血浆中的白细胞介素6和白细胞介素1β等炎症因子水平升高，炎症加剧。相关的炎症通路研究显示，核因子κB 明显过度激活。这些结果表明，抑制 DNA 甲基化会导致脑缺血后炎症严重的小鼠出现不良的功能预后。抑制DNA去甲基化可逆转上述变化。结果表明，DNA 甲基化可调节脑缺血的炎症反应，并在高炎症脑缺血的功能预后中发挥重要作用。

http://orcid.org/0000-0002-9976-2341 (Yongjun Wang); https://orcid.org/0000-0002-4713-5418 (Zixiao Li)

Abstract: Inflammation is closely related to stroke prognosis, and high inflammation status leads to poor functional outcome in stroke. DNA methylation is involved in the pathogenesis and prognosis of stroke. However, the effect of DNA methylation on stroke at high levels of inflammation is unclear. In this study, we constructed a hyperinflammatory cerebral ischemia mouse model and investigated the effect of hypomethylation and hypermethylation on the functional outcome. We constructed a mouse model of transient middle cerebral artery occlusion and treated the mice with lipopolysaccharide to induce a hyperinflammatory state. To investigate the effect of DNA methylation on stroke, we used small molecule inhibitors to restrain the function of key DNA methylation and demethylation enzymes. 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride staining, neurological function scores, neurobehavioral tests, enzyme-linked immunosorbent assay, quantitative reverse transcription PCR and western blot assay were used to evaluate the effects after stroke in mice. We assessed changes in the global methylation status by measuring DNA 5-mc and DNA 5-hmc levels in peripheral blood after the use of the inhibitor. In the group treated with the DNA methylation inhibitor, brain tissue 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining showed an increase in infarct volume, which was accompanied by a decrease in neurological scores and worsening of neurobehavioral performance. The levels of inflammatory factors interleukin 6 and interleukin-1 beta in ischemic brain tissue and plasma were elevated, indicating increased inflammation. Related inflammatory pathway exploration showed significant overactivation of nuclear factor kappa B. These results suggested that inhibiting DNA methylation led to poor functional outcome in mice with high inflammation following stroke. Further, the effects were reversed by inhibition of DNA demethylation. Our findings suggest that DNA methylation regulates the inflammatory response in stroke and has an important role in the functional outcome of hyperinflammatory stroke.

Key words: DNA demethylation, DNA methylation, DNMT3A, functional outcome, hyperinflammatory state, interleukin, neuroinflammation, stroke, TET2

. DNA甲基化异常对高炎症状态缺血性脑卒中预后的影响[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2024, 19(10): 2229-2239.

Yubo Wang, Ling Zhang, Tianjie Lyu, Lu Cui, Shunying Zhao, Xuechun Wang, Meng Wang, Yongjun Wang, Zixiao Li. Association of DNA methylation/demethylation with the functional outcome of stroke in a hyperinflammatory state[J]. Neural Regeneration Research, 2024, 19(10): 2229-2239.

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引言

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延伸阅读

NRR：首都医科大学附属北京天坛医院李子孝/王拥军团队揭示DNA甲基化异常对高炎症状态脑卒中预后的影响及机制

撰文：王誉博，张凌，李子孝

脑卒中已成为中国居民主要致死和致残原因之一。脑卒中后炎症水平与脑卒中功能预后密切相关，高炎症状态常导致脑卒中不良预后。研究表明，在脑卒中动物模型中抑制神经炎症可以改善缺血性脑卒中损伤[1]。关于炎症和卒中预后的相关性及机制，一直以来是研究的热点。其中，DNA甲基化作为表观遗传学的重要机制，即参与了对炎症和脑卒中预后的调节。此前研究发现，在动物实验中，通过遗传或药物抑制DNA甲基转移酶(DNMTs)来下调DNA甲基化可以改善脑卒中预后[2]。但是，在临床中，重度脑卒中患者或合并基础炎症性疾病患者，常合并有高炎症状态，高炎症状态可干扰DNMTs表达并影响DNA甲基化程[3]。此部分患者DNA甲基化水平及其对脑卒中预后的影响可能有所不同。目前脑卒中合并高炎症状态的表观遗传表现及涉及作用通路仍缺乏深入的研究。

近期，首都医科大学附属北京天坛医院李子孝/王拥军团队在《中国神经再生研究（英文版）》（Neural Regeneration Research）上发表了题为“Association of DNA methylation/demethylation with the functional outcome of stroke in a hyperinflammatory state”的研究论文。该研究发现，在脑卒中合并高炎症状态下，通过药物抑制DNA甲基转移酶3A (DNMT3A）功能，会导致脑卒中患者梗死面积增大、更高的炎症水平及预后不良。相反，抑制DNA去甲基化转移酶-甲基胞嘧啶双加氧酶2 (TET2) 功能，可能对脑卒中预后有利。DNA甲基化可能影响不同的炎症信号通路，研究发现，NF-κB通路可能在其中发挥关键作用，为高炎症脑卒中后恢复提供了新的潜在治疗靶点。

研究假设，高炎症状态会影响调节DNA甲基化对脑卒中预后的反应。研究选取雄性C57/BL6小鼠，将其随机分为假手术组、对照组、抑制DNA甲基化组及抑制DNA去甲基化组。小鼠经连续3天分别尾静脉注射药物载体DMSO、DNMT3A抑制剂RG108及TET2抑制剂Bobcat339后，进行短暂性大脑中动脉栓塞(tMCAO)造模手术，于术中腹腔注射脂多糖模拟高炎症状态。术后24小时行神经功能评价后处死小鼠，取脑组织行梗死体积测量，并取缺血脑组织及外周血行DNA甲基化水平、炎症水平及炎症通路测定。结果表明，在高炎症状态下，抑制DNMT3A功能会导致梗死体积增加，而抑制TET2功能导致梗死体积减少（图1）。改良Garcia评分结果表明，与假手术组相比，所有缺血小鼠的神经系统评分均显著降低。与对照组相比，DNA甲基化抑制剂组在本体感觉、触觉、肢体对称、侧转、前肢行走等部分及总分得分较低。而DNA去甲基化抑制剂组则相反。这些结果表明，在高炎症状态下，干预DNA甲基化/去甲基化可能会影响卒中急性期的感觉运动功能。此外，研究人员通过旷场试验、错步实验、转棒试验及悬线试验评价小鼠运动行为缺陷，结果表明，脑卒中会导致小鼠运动能力下降，抑制DNA甲基化可能会加剧这种缺陷，而抑制DNA去甲基化则相反。为了验证干预后小鼠缺血脑组织DNMT3A和TET2 mRNA和蛋白表达水平的变化，研究人员对缺血脑组织进行RT-qPCR和Western blot分析。结果在DNA甲基化抑制剂组中检测到DNMT3A蛋白表达量下降，而在DNA去甲基化抑制剂组中发现到TET2表达量下降，验证了药物对甲基化水平的影响。接下来，为了验证连续给药RG108和Bobcat339诱导的全身甲基化状态的变化，研究人员通过ELISA检测了外周血中DNA 5-mc和DNA 5-hmc的水平。结果显示，与其他处理组相比，RG108导致DNA 5-mc显著降低， Bobcat339导致DNA 5-hmc显著降低。然后，研究人员采用RT-qPCR和WB检测缺血脑组织中IL-1β和IL-6 mRNA和蛋白表达水平。结果显示，DNA甲基化抑制剂组IL-6 mRNA和蛋白表达水平明显升高。相比之下，DNA去甲基化抑制剂组IL-6 mRNA和蛋白表达水平下降。同时，IL-1β的趋势与IL-6一致，但IL-6的变化更为明显（图2）。为了验证全身炎症水平，研究人员测量了外周血中IL-6的水平。与缺血脑组织一致，DNA甲基化抑制剂组IL-6水平显著升高，而DNA去甲基化抑制剂组结果相反。最后，为了进一步揭示现有结果，研究人员检测五种炎症通路的mRNA表达水平。结果显示，NF-κB通路的变化最为显著。其中，DNA甲基化抑制剂组的NF-κB mRNA表达较对照组显著上调，而DNA去甲基化抑制剂组的NF-κB mRNA表达相对较低（图3）。最后，通过WB验证了NF-κB通路的关键复合物蛋白NF-κB p65，发现磷酸化的NF-κB p65 (代表NF-κB的活化)的表达水平在DNA甲基化抑制剂组最高，在DNA去甲基化抑制剂组较低，与mRNA表达水平一致。

该研究发现抑制DNMT3A功能导致高炎症脑卒中后梗死体积扩大，功能预后恶化。相反，抑制TET2可能具有相对有益的结果。先前的研究表明，缺血后总DNA甲基化水平升高可能使脑卒中预后恶化，同时，也有证据表明TET2可能具有神经保护作用，抑制TET2会增加梗死体积。这些不同的结果可能是由于正常的脑卒中后炎症反应和高炎症环境之间的差异。一种可能的解释是，DNA甲基化在脑卒中当中具有保护或损害神经的双重作用，可能与脑卒中的阶段和严重程度密切相关。凋亡机制参与轻度缺血，而兴奋毒性和自由基介导的机制在长时间缺血后发挥更主要的作用。DNA低甲基化的神经保护作用可能在由凋亡机制驱动的轻度脑卒中中更为突出。在实验中，LPS应用可以促进氧消耗和自由基生成，从而增强氧化应激和兴奋性毒性。过度炎症可改变脑卒中模式及其主要损伤机制，限制DNA低甲基化的保护作用。

脑卒中通常被认为是一种由脑部局部缺血或出血性事件引起的神经系统疾病。然而，越来越多的证据表明，脑卒中不仅仅是局部脑损伤，而是涉及多个器官和系统的全身性疾病。炎症反应是卒中全身性影响的关键机制之一。卒中后，炎症介质被释放到血液循环中，引起全身炎症反应，影响远端器官和大脑以外的系统。研究结果表明，抑制DNA甲基化和去甲基化导致高炎性脑卒中后DNA甲基化水平和炎症的全身性变化，这与缺血性脑组织一致。因此，越来越清楚的是，脑卒中是一种复杂的多器官疾病，需要系统的方法来管理和预防。另外，研究通过进一步筛选脑卒中后炎症通路的表达，发现在高炎症状态下，DNA甲基化干预导致脑卒中后炎症通路发生变化，尤其是NF-κB通路。这些发现为今后的研究方向指明了方向，并可能为高炎症状态下的脑卒中的靶向治疗提供依据。#br# 在目前的研究中，高炎症状态下，抑制DNA甲基化水平对脑卒中预后具有显著的不良作用。然而，本研究中也有一些缺陷和不足。例如，使用药物干预DNA甲基化相较DNA甲基化基因条件敲除小鼠缺乏稳定性和可重复性。此外，研究发现，高炎症状态下，不同DNA甲基化程度的炎症通路反应程度不同。接下来，需要更多的试验进一步完善DNA甲基化和卒中机制的研究，未来的研究应更详细地聚集并探讨相关的分子机制。

图1 在卒中高炎症状态下，抑制DNMT3A功能会增加梗死体积，而抑制TET2则相反

图2 脑组织缺血区域炎症因子水平改变情况

图3 在卒中高炎症状态下，DNA甲基化/去甲基化改变影响NF-κB通路

原文链接：https://doi.org/10.4103/1673-5374.392890

参考文献：

[1]Jayaraj RL, Azimullah S, Beiram R, et al. Neuroinflammation: friend and foe for ischemic stroke. J Neuroinflammation. 2019;16:142.

[2]Kassis H, Shehadah A, Chopp M, et al. Epigenetics in stroke recovery. Genes (Basel). 2017;8:89.

[3]Niwa T, Tsukamoto T, Toyoda T, et al. Inflammatory processes triggered by Helicobacter pylori infection cause aberrant DNA methylation in gastric epithelial cells. Cancer Res. 2010;70:1430-1440.