1 研究意义
神经胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,恶性胶质瘤具有手术切除不彻底,对放疗不敏感,预后差的特点,极大地威胁着患者的生命, 目前传统的治疗方法包括手术治疗、放射治疗及化学治疗,但仍生存期短，复发率高,很难彻底治愈。长期以来,针对脑肿瘤的临床基础研究投入很大,但收效亦不尽人意在，胶质瘤治疗的复杂及艰难由此可见一斑。基因治疗是现今科技水平阻滞胶质瘤恶魔施虐的最前卫的武器之一，恶性胶质瘤的基因治疗研究在靶基因选择方面已经进行了大量的探索，迄今尚未发现理想的表达调控策略及与之相匹配的基因投递系统以完成基因治疗的任务，有必要研究更为理想的表达调控策略及与之相匹配的基因投递系统。近几年国际上microRNA的表达及功能的研究成为基因治疗领域新热点，有望成为继siRNA后更为理想的基因治疗调控表达策略。国内外人脑胶质瘤细胞miRNA表达谱初步研究发现，有多种miR一致表达明显下调[1，2]，迄今为止,PubMed对其中明显下调的miR-7还没有利用慢病毒介导miRNA骨架携带稳定高表达相应的miR对胶质瘤生物学效应观察的研究报告。有实验初步证实质粒介导的miR-7有一定的瞬时抑制胶质瘤生长的效应[3-4]。慢病毒载体较质粒载体具有将外源基因引入分裂及非分裂细胞基因组并持续稳定表达的优势，本研究首先构建针对人胶质瘤的miR-7-3慢病毒载体，进行病毒包装、扩增、浓缩纯化及滴度测定后，感染胶质瘤细胞株U251,筛选获得稳定高表达相应miR的胶质瘤细胞系，为对胶质瘤的功能研究奠定较好的基础；再研究以上miR对胶质瘤细胞的生物学效应，包括细胞增殖、细胞周期、凋亡及主要癌基因转导通路蛋白表达等的变化揭示miR-7-3对胶质瘤细胞活性的影响。该研究为研发理想的基因治疗药物提供新靶标。并为进一步体内基因治疗提供依据，最终有望应用于胶质瘤的临床治疗，为广大患者带来福音。
2 国内外研究状况的微观分析
MicroRNA(简称miRNA)是一类长约21-24 nucleotide (nt)的非编码小分子RNA，包括线虫、果蝇、家鼠、人体以及拟南芥、水稻等生物体中广泛存在，是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。MicroRNA通过促使靶mRNA降解或抑制其翻译来调节靶基因的表达，在细胞的分化、增殖和凋亡，个体发育、机体代谢以及病毒感染中都具有重要的作用。目前,miRNA 已知的功能是在转录后水平调控基因的表达,主要作为基因表达的负调控因子,每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。近年的研究明,miRNA 表达失调与多种肿瘤相关,并且这些miRNA 可能起肿瘤抑制基因或癌基因的作用[1-3] 。利用这种作用，可将其作为抗肿瘤药物或者其他抗肿瘤药物的靶点之一。尽管不同的肿瘤组织中miRNA 的表达谱各有不同，而有趣的是有几个miRNA 在所有的肿瘤中几乎都有表达水平的上调或下调，另外这几个miRNA 的作用靶点，几乎无一例外位于已知的原癌基因上，所有这些证据都提示这几个miRNA在肿瘤的发生中担任着重要的角色。对miRNA靶目标的生物信息学预测揭示了可能属于miRNA介导的调控的多样性调节途径。因此，有必要研究microRNA的特定环境靶基因，并针对其作用机理开发胶质瘤特异性的诊断和治疗方案，这也是基因治疗研究的最终方向。
miRNA发挥生物学功能的基础是与目的mRNA互补配对。对于在肿瘤细胞中表达上调的miRNA，有学者使用miRNA的反义寡核昔酸(anti-miRNA oligonucleotides)与相应miRNA特异性结合，与目的mRNA竞争，从而达到阻断miRNA和mRNA互补结合的目的。Meister等体外把miR-21的反义2-氧甲基修饰的RNA (2’-Omethyl-modified antisense RNA)导人宫颈癌细胞，发现细胞内miR-21的表达明显受抑制。Krutzfeldt等将化学合成的反义寡核苷酸首次使用于小鼠体内，分别抑制miR-16，miR-122，miR-192和miR-194的表达，也取得了一定的抑瘤效果。这些结果都为miRNA肿瘤生物学治疗打下了良好基础。此外，最近转导有抑制肿瘤生长的miRNA进入细胞，探讨其对肿瘤生长的抑制作用，目前成为基因治疗的热点。最近有学者用逆转录病毒携带表达miR-125b-1可抑制人肺癌细胞活性[3]。Takamizaw[4]等将let-7的基因装载入pHl-RNApuro质粒，转染A549肺癌细胞株，发现肿瘤生长受到抑制。在脑胶质瘤的基因治疗领域，国内外学者也开始关注miR对胶质瘤的生物活性影响，有学者发现利用miR-21的反义2-氧甲基修饰的RNA可以对胶质瘤细胞系的活性有一定的抑制作用[5]。国内尤永平、石磊等最近发现转染miR-181a 、 miR-181b寡聚核苷酸对胶质瘤生长有抑制作用[6]，黄庆峰等设计并合成对靶向垂体瘤转化基因1（PTTG1）表达质粒，可部分抑制恶性人脑胶质瘤U251细胞增殖和侵袭[7]，也有学者发现miR-124、miR-137瞬时转染对胶质瘤生长有抑制作用[1]，但迄今miRNA在胶质瘤中的作用研究仍极少见报告，鉴于miRNA的胶质瘤基因治很可能是今后胶质瘤治疗的新途径，很有必要在该领域进行深入探索。
目前研究发现, miR-7
、miR-129、
miR-138、miR-328、miR-330对肿瘤细胞的增殖分化有重要影响。miR-7位于染色体的9q21.32，miR-7在多种癌症组织中低表达，而多种正常组织中均高表达
[8]。目前发现揭示mir-7是细胞增殖分化的十分重要的调控因子，有实验证明，其对癌基因表达主要通路之一的表皮生长因子（epidermal growth factorinal receptor,EGFR）通路的活化有重要影响，其表达增高可抑制EGFR通路的活化。在果蝇眼中的光感受器中 miR-7作用于
EGFR受体[9]。miR-7对放疗毒性有重要保护作用，对DNA基因组的稳定及甲基化有重要调控作用[10]。Webster发现，在肺、乳腺、胶质瘤中miR-7的功能异常基突变表达与癌基因有密切联系，通过细胞凋亡基周期阻滞起作用，它作用于
EGFR基因3’-UTR端，包含mir的3个作用位点的两个，下调EGFR的表达[11]。还有实验发现miR-7表达与Pak1（p21活性酶）表达在癌组织中呈负相关，在乳腺癌中，由低度到高度侵袭性恶性进展中，Pak1逐渐上调，而miR-7及其上游活性因子逐渐下调，通过靶向性作用于其
3'- UTR区， miR-7可能抑制Pak1（p21活性酶）表达并降低肿瘤活性及侵袭能力[12]。目前发现其在脑胶质瘤中表达明显降低，实验显示在间变星型细胞瘤及胶质母细胞瘤中，miR-7表达下调
13及34倍[1]。有实验发现，miR-7抑制
EGFR及其下游主要通路AKT（丝/苏氨酸激酶）通路并与周围对照脑组织相比，在胶质母细胞瘤中明显下调,其对EGFR通路有靶向性抑制，转染miR-7减少了原发性胶质母细胞瘤细胞株的侵袭性及活性，该研究推测miR-7可能作为主要癌通路
EGFR上的调控因子对胶质母细胞瘤细胞活性有抑制作用[11-13]。最近国内外学者发现, miR-129、
miR-138、miR-328、miR-330也在胶质瘤中表达明显下调[2]，miR-129、
miR-138、miR-328、miR-330对某些肿瘤生长有抑制作用[14-18]，在膀胱肿瘤细胞系T24 及SW780中, miR-129明显抑制肿瘤细胞的生长并引起凋亡
[14]。
miR－138可下调P-
glycoprotein及Bcl-2蛋白表达，引起白血病凋亡[15]MCF-7/MX100中BCRP/ABCG2蛋白活性，增强对抗肿瘤药物米托蒽醌的敏感性[17]，miR-330可引起前列腺癌细胞的凋亡[18]。这些研究结果提示miR-7、miR-129、miR-138、miR-328、miR-330表达程度对肿瘤细胞的生长活性有重要影响,这些miR表达下调是在胶质瘤发生过程中伴随发生的事件,它也可能是胶质瘤的一个潜在的生物标志。但是,这些miR是在胶质瘤发生过程中具有直接的作用还是只是在胶质瘤中受到了异常的调节,其对胶质瘤细胞的发生发展、凋亡等生物特性的基因表达谱的影响，它们对胶质瘤的增殖活性的生物学效应研究迄今国内外尚未见报告，很有必要进一步探讨。,在头颈鳞状细胞癌细胞系中，抑制侵袭活性，促进凋亡[16]。miR-328可直接下调肺部癌细胞系慢病毒源性载体(Lentivirus based vector，LV)最主要的优点是它能将外源基因入分裂细胞和非分裂细胞的基因组内，为体外难以转染及原代培养的细胞提供了潜在的传递系统，且对体内基因转移有效[19-20]。近年来发现，慢病毒作为RNA干扰载体工具有其独特的优势，慢病毒是一类免疫缺陷性病毒，也是一类逆转录病毒载体。它既能够感染分裂细胞，也能够感染非分裂细胞，这是因为慢病毒载体在感染的过程中可形成前整合复合体。前整合复合物可定位到核孔，然后通过核孔进入细胞核，即不需要有丝分裂，也能有效地感染非分裂细胞。慢病毒基因组可以直接稳定整合在细胞基因组上，通过人体生理情况下pre-miRNA携带miRNA出核方式出核，并且可以持续表达之，符合体内的生理情况。
我们在预实验中发现直接用脂质体携带干扰质粒转染 U251细胞的效率不高，不便于进行下一步的工作，而转染是瞬时的，只能观察到短期的干扰效果，对神经细胞来说，如果用慢病毒去感染，感染效率要高于直接转染的效率，并且可以持续表达之,从而更利于下面的功能实验。本实验希望最后可以在动物体内进行实验，观察较长期的干扰效果，考虑用慢病毒作输送系统较为合适，所以选择构建慢病毒载体。本研究拟采用的RNAi慢病毒系统是基于miRNA系统的，由CMV启动子启动，进入细胞后稳定整合在基因组上，通过pre-miRNA结构携带以上相关miR基因进入细胞内发挥RNAi作用，有自己的独特性，符合人体生理情况，潜在的副作用小。
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所投文章创新性的分析
3 项目的特色和创新之处
①本课题计划从改变表达调控策略为切入点，以胶质瘤中microRNA明显下降表达异常并与抑制胶质瘤活性有密切相关性的miR-7-3为潜在基因治疗药物，构建相应的miR慢病毒,目前已经成功构建了miR-7-3慢病毒载体。
②miR-7-3慢病毒进行感染胶质瘤细胞并检测其生物学效应，主要包括细胞增殖、细胞周期、EGFR通路AKT2等的分子水平的表达。
4 文章区别于他人他篇的特点
近几年国际上microRNA的表达及功能的研究成为基因治疗领域新热点，有望成为继siRNA后更为理想的基因治疗调控表达策略。肿瘤的发生是细胞增殖、凋亡和分化失衡的结果。越来越多的研究证实许多microRNA具有促进细胞增殖和存活的作用，同时还有许多microRNA具有抑制细胞增殖和存活的作用，这两类microRNA作为癌基因和抑癌基因在肿瘤的发生发展过程中各自发挥着重要的作用。慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒I型(HIV I)病毒，为去除或减少其致病性，人们常将携带目的基因的载体、糖蛋白抗原聚合酶(gag/pol)及包膜蛋白(env)构建在不同的质粒中，各质粒单独存在时既不能形成病毒颗粒，也不具备转导能力，包装后能产生携带目的基因的重组慢病毒(是一类缺陷病毒)，离开包装细胞后病毒颗粒仅能转导细胞，但不能自我复制，此为其安全性提供了更为有效的保证。现在使用的慢病毒载体大多是四质粒系统。本课题即是pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G，分别独立放置在3个质粒上，另外的一个就是可以放目的基因的质粒Lenti-GFP-miR-7-3（包含有miR-7-3）。四质粒系统将pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G分别放在不同的载体上，增强了病毒载体的安全性。慢病毒载体既能感染分裂活跃期细胞，又能高效率感染分裂缓慢或非分裂期的细胞；能够携带较大及多个外源性基因，转染后对转录沉默作用有较强的抵抗力，能长期稳定表达目的基因。miR-7-3位于染色体9q21，在胶质瘤中明显表达下调，本研究成功构建并包装了表达miR-7-3基因的重组慢病毒载体，并证实其感染人胶质瘤U251细胞后可有效表达。
恶性胶质瘤的基因治疗领域内，其中癌基因EGFR的激活、过表达或扩增、重排，为形成恶性胶质瘤的重要分子途径之一。EGFR激活后激活众多的下游信号路径，其中研究明确的主要被激活通路之一是磷脂酰肌醇-3羟基激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase ，PI3K）-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/threonine Kinase，AKT；Protein kinase B，PKB）通路。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）为生长因子受体超家族信号转导过程中的重要成员，AKT 也称蛋白激酶E（PKB），AKT是位于PI3K下游的一个重要激酶，二者均是促进细胞生存和维持细胞正常功能关键的信息分子，并且一道构成细胞对外应激反应过程中的促进细胞生长、抑制细胞凋亡和维持细胞重要功能的信号传递链。AKT通过下游通路影响肿瘤细胞的细胞周期的推进、凋亡的启动、端粒酶的活性、肿瘤血管的生成和肿瘤的侵袭。已经发现部分肿瘤的发生发展与AKT2的异常有关。miR-7-3慢病毒进行感染胶质瘤细胞并检测其生物学效应，主要包括细胞增殖、细胞周期、EGFR通路AKT2等的分子水平的表达。本课题为胶质瘤基因治疗提供了新思路。
5 专家意见与答疑
专家意见：研究Mir-7转染对胶质瘤细胞增殖及细胞周期的影响，国内外均有较多相似文献报道。
作者答疑：本课题是利用miR-7-3作为肿瘤的靶向基因治疗药物，而目前国内外相似文献多以 miR-7-1为靶向药物，迄今我们尚未见到利用miR-7-3作为胶质瘤的靶向基因治疗药物治疗的文献（见文献37、38）。 miR-7-1与 miR-7-3功能有所不同。此外， 我们文献检索发现均为瞬时转染或脂质体包埋质粒转染， Mir-7体外转染的瞬时表达时间周期短，而且与慢病毒载体转染率有很大的差异，不能等同目前共认的可持续而稳定的表达外源性基因慢病毒表达载体，所以我们认为我们的实验结果对 Mir-7对胶质瘤细胞系的增殖及细胞周期的影响更有说服力并可进一步再体内实验。
