中国神经再生研究(英文版) ›› 2022, Vol. 17 ›› Issue (1): 99-100.doi: 10.4103/1673-5374.314309
基于氯仿沉淀的小规模腺相关病毒载体生产用于临床前基因传递
Small scale adeno-associated virus-vector production for preclinical gene delivery based on chloroform precipitation
Marcus Davidsson*, Andreas Heuer*
- Molecular Neuromodulation, Department of Experimental Medical Sciences, Lund University, Lund, Sweden (Davidsson M)
Behavioural Neuroscience Laboratory, Department of Experimental Medical Sciences, Lund University, Lund, Sweden (Heuer A)
摘要：
Neural Regen Res：氯仿沉淀腺相关病毒载体和非病毒纳米颗粒的基因治疗
科学的进步使人们有可能诱发从基因组的大范围操作到单个核苷酸的变化。将基因信息导入靶细胞的金标准载体是病毒载体。腺相关病毒载体是一种小的单链DNA病毒，能自然感染人类和其他灵长类动物的细胞，因此成为基因治疗的理想候选。与逆转录病毒（如慢病毒载体）相比，腺相关病毒缺乏复制，不能整合到宿主基因组中，从而降低了插入突变的风险。目前还不知道腺相关病毒会导致人类任何疾病。腺相关病毒具有良好的生物安全性，大约80-90%的人口已经携带病毒。已知约有13种自然发生的变体（血清型），每种变体对特定细胞/组织类型具有不同的倾向性。在临床上，腺相关病毒载体已被证明能实现稳定的、长期的转基因表达。两百多项临床试验正在进行中，或使用腺相关病毒载体平台完成(www.clinicaltrials.gov)，针对多种疾病，如A型和B型嗜血、杜氏肌营养不良、脊髓性肌萎缩、Leber先天性黑蒙，还有神经退行性疾病。两种基于腺相关病毒的药物已经获得美国食品药品监督管理局的批准，2017年Luxturna用于治疗罕见的遗传性视网膜营养不良，2019年Zolgensma用于治疗脊髓性肌萎缩。在临床前研究中，腺相关病毒载体是实现多种生物系统中不同组织类型的转基因表达的关键。通过使用细胞类型特异性增强子/启动子、组织选择性衣壳变体或条件表达系统（例如Cre重组酶或四环素），这些载体已用于组织标记和电路追踪、细胞活性操纵（例如光遗传学、化学遗传学）、活性监测（例如钙指标）、疾病建模（例如蛋白质过度表达）和基因编辑（例如CRISPR/Cas）。未来的研究主要集中在获得更高的细胞类型特异性（向性）、转导效率（转基因表达）、避免宿主免疫反应和提高病毒衣壳的包装能力。
来自瑞典隆德大学的Andreas Heuer团队认为随着大量高基因组拷贝滴度载体在临床应用和临床前全身注射研究中的应用，需求增加，提高产量是未来的一个挑战。为了实现细胞特异性、增加和细胞特异性转基因表达、更大的载货量以及提高产量，目前正在进行一些研究，主要集中在i）病毒壳体开发、ii）表达盒和iii）生产方法。新的天然和合成腺相关病毒壳体变异体正在不断被发现和开发。由于氯仿方案允许快速生产多批小体积（25-40μL）的产品，因此它是一种理想的内部测试方法，再采用任何生产方法生产更大体积的纯化腺相关病毒。Andreas Heuer团队已经用氯仿法检测了血清型和工程化病毒壳体，产生了数百批。通过使用氯仿方案，可以在一天内收获和纯化>20批病毒，而使用标准碘沙醇方案则需要相当长的时间。尽管基因治疗有着巨大的前景，但在该领域取得快速进展的主要限制是测试各种结构所需的时间和财力。尽管Andreas Heuer团队预计，最近开发的技术，如条形码或计算机引导产生新的变体，将大大加快发展和缩小目标，体内测试选定的结构将仍然是黄金标准。基于腺相关病毒载体和非病毒纳米颗粒的基因治疗将继续提供独特的机会来纠正缺陷基因并快速改善人类健康。对基因的精确控制，如碱基和基本编辑，有可能彻底改变个性化的医学。
文章在《中国神经再生研究（英文版）》杂志2022年 1 月 1 期发表。
https://orcid.org/0000-0003-0233-0516 (Marcus Davidsson); https://orcid.org/0000-0003-0300-7606 (Andreas Heuer)