(一) 本文实验设计构思介绍
神经干细胞是侧脑室室下区和海马齿状回颗粒下区具有可再生和多向分化能力的祖细胞。神经干细胞的增殖与神经修复受到SHH信号通路相关分子的调节,可是SHH信号通路调节神经干细胞增殖与神经修复的机制并未详细阐明。有文献报道在颗粒细胞中由SHH刺激后,采用基因芯片分析SHH可诱导细胞周期调控基因N-myc的高表达。过表达N-myc足以促进细胞增殖,活化的N-myc是SHH调控细胞增殖机制的重要分子机制。我们设想在神经干细胞中,N-myc是SHH信号通路的直接靶基因。所以,我们分离并纯化大鼠脑室下区神经干细胞,提取RNA、反转录、PCR得到SHH-N的cDNA,克隆入pSNAV2.0-CMV-IRES-EGFP,包装得到腺相关病毒rAAV-SHH-N–EGFP,感染神经干细胞48h后采用实时定量PCR检测SHH信号通路下游相关基因的mRNA水平变化,以此探索SHH可引起神经干细胞的增殖的分子机制。
(二) 国内外同类研究水平的介绍
1. shh信号通路:在大部分细胞中,SHH信号通路由SHH、Patched(Ptc)和Smoothed (Smo) 2个跨膜受体组成的受体复合物,蛋白激酶A 及下游转录因子Gli家族(Glil、Gli2、Gli3)等组成。信号传导时,SHH和Ptc结合,Ptc-Smo复合物解离,Smo进入胞内,激活下游的转录因子Gli家族。
2. 有文献报道在颗粒细胞中由SHH刺激后,采用基因芯片分析SHH可诱导细胞周期调控基因N-myc的高表达,过表达N-myc足以促进细胞增殖,活化的N-myc是SHH调控细胞增殖机制的重要分子机制。
(三) 本文与其他同类研究的比较
1. 未有文献报道在神经干细胞中shh信号通路与N-myc基因表达的关系。
2. 未有文献报道在神经干细胞中N-myc参与shh信号通路调节细胞增殖。
3. 本文证明在神经干细胞中,N-myc是信号通路的直接靶基因,同时N-myc可能是shh信号通路调节神经干细胞增殖的分子机制之一。
(四) 本文先进性、创新性及其特色
先进性:神经干细胞是侧脑室室下区和海马齿状回颗粒下区具有可再生和多向分化能力的祖细胞。神经干细胞的增殖机制的研究一直是近年来的研究热点,干细胞的增殖受到多种信号通路与相关基因的影响,找出神经干细胞增殖的“阀门”基因或分子调节机制,便可以在分子水平调节干细胞的增殖,甚至是分化。本文本文证明在神经干细胞中,N-myc是信号通路的直接靶基因,同时N-myc可能是shh信号通路调节神经干细胞增殖的分子机制之一。
创新性:1.以往采用外源性shh蛋白刺激神经干细胞,细胞对shh信号分子反应性差,不利于基因治疗的基础研究。文章采用腺相关病毒刺激神经干细胞,取得了较好的效果,为体内基因治疗试验打下基础。2.在神经干细胞中,经典的SHH信号通路GLI1对N-myc表达的影响在以往的研究中未有详细的阐述。3.本试验从分子水平,证明在神经干细胞中,N-myc是信号通路的直接靶基因,同时N-myc可能是shh信号通路调节神经干细胞增殖的分子机制之一。
特色:本试验从分子水平,证明在神经干细胞中,N-myc是信号通路的直接靶基因,同时N-myc可能是shh信号通路调节神经干细胞增殖的分子机制之一。