1 实验设计构思介绍
目前应用于杜氏肌营养不良治疗研究的干细胞类型已有多种,包括脂肪源性干细胞、骨髓干细胞等,效果最肯定的是胚胎干细胞,研究最多的是骨髓干细胞,目前最热点的是多能干细胞,但脂肪源性干细胞由于取材方便、来源丰富,仍不失为一种极佳的干细胞种子细胞,为患者自体干细胞移植提供了可能。但是杜氏肌营养不良细胞本身有基因缺陷,且移植后的干细胞的成肌分化比率一直是个难关,因此对其进行基因纠正和成肌基因修饰后的干细胞移植,则非常有意义。如此,便牵涉到转基因的载体的选择,质粒、病毒等具有多种,而各有优缺点。杆状病毒本来是一种昆虫病毒,被广泛应用于蛋白表达等,近年来作为逐渐被发现作为一种新型的哺乳动物基因载体,具有容量大、毒副作用小等优点,成为国内外不少专家、学者的研究热点。而较早将杆状病毒用作干细胞的基因载体的有台湾学者Ho YC, Chen HC, Wang KC, et al,目前文献中有人骨髓间充质干细胞、人脂肪源性干细胞已有报道,但应用于杜氏肌营养不良治疗研究的模型鼠来源的特异的基因缺陷的脂肪干细胞的研究属创新实验设想。另外,作为促进干细胞成肌分化的研究已有很多,而胚胎期wnt/β-连环蛋白信号传导通路在促进成肌中发挥重要作用,那么损伤的肌肉组织中该信号通路是否其同样作用?杜氏肌营养不良是最常见的神经遗传性肌肉病,无有效疗法,患儿一般3-5岁发病,12岁坐轮椅,20多岁死亡,预后极差。本研究基于前期多种干细胞治疗杜氏肌营养不良模型鼠的研究和取得的良好结果,本研究拟通过构建携带抗肌萎缩蛋基因和β-连环蛋白的重组杆状病毒,感染dko供体鼠来源的脂肪源性干细胞, 体外扩增后再输入抗肌萎缩蛋白基因及抗肌萎缩蛋白相关蛋白双敲除受体鼠来治疗杜氏肌营养不良模型鼠,并进行一系列检测来评价疗效,同时探讨其成肌机制。
尚延昌等的研究已对该问题做出了初步的肯定的回答,而其研究对象主要是骨髓间充质干细胞,而其模型鼠是mdx鼠,其表型较轻,与杜氏肌营养不良严重的临床表型不符。相反,本研究采用了症状严重的抗肌萎缩蛋白基因及抗肌萎缩蛋白相关蛋白双敲除鼠的脂肪细胞作为研究对象,更适宜于杜氏肌营养不良的治疗研究。
2 国内外同类研究水平的介绍
目前国内外,关于杆状病毒作为哺乳动物基因载体已逐渐成为热点,且在蛋白表达 领域已被应用。而干细胞治疗疾病的研究是国内外研究的热点,而我们课题组是国内外干细胞治疗杜氏肌营养不良模型鼠研究的知名课题组,有多年干细胞移植治疗动物模型的经验。
文章区别于他人的文章的地方主要在于选择成体脂肪源性干细胞,自体移植可避免免疫排斥,但其自身基因的缺陷需要纠正,选择了克隆容量大的杆状病毒作为基因载体进行基因转基因,并对基因纠正和修饰过的基因缺陷的模型鼠干细胞进行成肌诱导,经过试验研究,观察到转基因的干细胞的成肌分化受到促进。从而印证了试验最初的设想,通过基因修饰干预杜氏肌营养不良模型鼠的成体脂肪源性干细胞,可促进其成肌分化,为杜氏肌营养不良的自体干细胞治疗方法提供了实验依据。
3 文章创新性的分析
主要文献检索来自 pubmed、CNKI、万方等数据库,检索时间范围1979-2010,关键词:baculovirus; adipose-derived stem cells; duchenne muscular dystrophy; microdystrophin; β-catenin; myogenesis. 检索出英文文献220篇,中文文献92篇,对文献报道的杆状病毒应用于哺乳动物细胞基因载体、脂肪源性干细胞可多向诱导分化、以及microdystrophin和β-catenin可促进干细胞成肌分化得到肯定的结果。