富含基因的浓缩白细胞自体灌注对小型猪模型创伤脊髓重塑有积极的作用

doi:10.4103/1673-5374.360241

摘要/Abstract

摘要：

创伤后的脊髓重塑包括退化和再生过程，这影响了脊髓损伤后功能恢复的有效性。脊髓损伤的基因治疗可以诱导神经组织重塑的积极变化。作者在其既往研究中，为了有治疗作用的基因传递至脊髓损伤部位，开发了一种新的方法，即使用携带重组cDNA的嵌合型腺病毒（Ad5/35）体外转导的自体浓缩白细胞。此次研究评估了同时产生重组血管内皮生长因子、胶质细胞源性神经营养因子和神经细胞粘附分子的遗传富集的浓缩白细胞静脉输注对中度脊髓损伤小型猪模型损伤脊髓组织重塑的分子和细胞变化的影响。实验根据损伤的中心点，对治疗动物的喙部和尾部的脊髓再生进行了形态学和免疫荧光分析，结果显示，自体灌注遗传富集的浓缩白细胞使脊髓损伤小型猪：(1)灰质完整度和脊髓细胞的存活率提高（Caspase-3阳性细胞数量减少，Hsp27的表达减少）；(2)突触蛋白的表达恢复。(3)星形胶质增生减少（GFAP阳性星形胶质细胞和Iba1阳性小胶质细胞的面积减少）；(4) βIII-管蛋白阳性轴突的再生率提高，同时侧皮质脊髓束区域的Olig2阳性少突胶质细胞数量增加。这些结果显示，静脉输注产生重组血管内皮生长因子、胶质细胞源性神经营养因子和神经细胞粘附分子的自体富集浓缩白细胞对创伤后重塑脊髓神经组织的分子和细胞学水平有积极作用。这些数据为脊髓损伤的新基因治疗方法应用提供了一个坚实的实验基础。

https://orcid.org/0000-0002-6632-4636 (Rustem Robertovich Islamov)

Abstract: Post-traumatic spinal cord remodeling includes both degenerating and regenerating processes, which affect the potency of the functional recovery after spinal cord injury (SCI). Gene therapy for spinal cord injury is proposed as a promising therapeutic strategy to induce positive changes in remodeling of the affected neural tissue. In our previous studies for delivering the therapeutic genes at the site of spinal cord injury, we developed a new approach using an autologous leucoconcentrate transduced ex vivo with chimeric adenoviruses (Ad5/35) carrying recombinant cDNA. In the present study, the efficacy of the intravenous infusion of an autologous genetically-enriched leucoconcentrate simultaneously producing recombinant vascular endothelial growth factor (VEGF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), and neural cell adhesion molecule (NCAM) was evaluated with regard to the molecular and cellular changes in remodeling of the spinal cord tissue at the site of damage in a model of mini-pigs with moderate spinal cord injury. Experimental animals were randomly divided into two groups of 4 pigs each: the therapeutic (infused with the leucoconcentrate simultaneously transduced with a combination of the three chimeric adenoviral vectors Ad5/35‐VEGF165, Ad5/35‐GDNF, and Ad5/35‐NCAM1) and control groups (infused with intact leucoconcentrate). The morphometric and immunofluorescence analysis of the spinal cord regeneration in the rostral and caudal segments according to the epicenter of the injury in the treated animals compared to the control mini-pigs showed: (1) higher sparing of the grey matter and increased survivability of the spinal cord cells (lower number of Caspase-3-positive cells and decreased expression of Hsp27); (2) recovery of synaptophysin expression; (3) prevention of astrogliosis (lower area of glial fibrillary acidic protein-positive astrocytes and ionized calcium binding adaptor molecule 1-positive microglial cells); (4) higher growth rates of regenerating βIII-tubulin-positive axons accompanied by a higher number of oligodendrocyte transcription factor 2-positive oligodendroglial cells in the lateral corticospinal tract region. These results revealed the efficacy of intravenous infusion of the autologous genetically-enriched leucoconcentrate producing recombinant VEGF, GDNF, and NCAM in the acute phase of spinal cord injury on the positive changes in the post-traumatic remodeling nervous tissue at the site of direct injury. Our data provide a solid platform for a new ex vivo gene therapy for spinal cord injury and will facilitate further translation of regenerative therapies in clinical neurology.

Key words: autologous genetically-enriched leucoconcentrate, chimeric adenoviral vector, gene therapy, glial cell line‐derived neurotrophic factor, mini-pig, neural cell adhesion molecule, spinal cord contusion injury, vascular endothelial growth factor

. 富含基因的浓缩白细胞自体灌注对小型猪模型创伤脊髓重塑有积极的作用[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2023, 18(7): 1505-1511.

Maria Aleksandrovna Davleeva, Ravil Rasimovich Garifulin, Farid Vagizovich Bashirov, Andrei Aleksandrovich Izmailov, Leniz Faritovich Nurullin, Ilnur Ildusovich Salafutdinov, Dilara Zilbarovna Gatina, Dmitrij Nikolaevich Shcherbinin, Andrei Aleksandrovich Lysenko, Irina Leonidovna Tutykhina, Maksim Mikhailovich Shmarov, Rustem Robertovich Islamov. Molecular and cellular changes in the post-traumatic spinal cord remodeling after autoinfusion of a genetically-enriched leucoconcentrate in a mini-pig model[J]. Neural Regeneration Research, 2023, 18(7): 1505-1511.

参考文献

引言

出版重点

《中国神经再生研究（英文版）》杂志为SCI、PubMed数据库收录的国际唯一一本专注神经再生领域研究的经同行评议的开放获取期刊，出版来自全球神经再生领域专业学者的前沿性基础研究及临床研究及转化医学、循证医学优秀的最新成果。

期刊出版来自于脑损伤与神经再生、脊髓损伤与神经再生、周围神经损伤与神经再生和神经退行性病与神经再生、神经影像与神经再生的相关研究。期刊关注神经损伤与再生过程中的轴突再生、突触生长、神经可塑性、神经修复和替代、神经移植等最新研究成果。尤其关注应用细胞治疗、基因治疗、生物因子治疗、药物治疗、手术治疗、康复治疗、物理疗法、组织工程、生物工程、生物材料、神经假体等干预性方法产生神经再生效果的相关研究。文章应清晰描述抑制神经元损伤、减轻神经元损伤的一系列变化，保护损伤神经元的过程、方法、程度与评价，突出从细胞分子水平以及分子生物学水平解释神经元损伤后以及预后再生的机制。

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延伸阅读

NRR：喀山国立医科大学团队开发脊髓损伤基因治疗新方法

脊髓损伤的基因治疗是神经康复领域的一个有前途的治疗策略，其可以防止脊髓创伤性损伤后空洞化和瘢痕化以及刺激神经再生（轴突生长、突触生成和恢复神经功能回路），以促进积极的脊髓重塑。

基因治疗载体腺病毒在应用过程中会出现较强的免疫反应问题。喀山国立医科大学Rustem Robertovich Islamov团队在以往研究中，为了克服这一问题，采用了自体白细胞与携带重组cDNA的腺病毒载体进行体外转导。这种方法可以防止腺病毒的负面影响，如对患者机体的免疫原性和毒性影响，并建议由白细胞临时合成和分泌重组治疗分子。

Islamov等在既往研究中，针对脊髓损伤基因治疗，提出了一种有效的、简单的、安全的个性化精确体外基因治疗方法，该方法基于静脉注射富含基因的浓缩白细胞。从小型猪外周血中获得的浓缩白细胞在血袋中用携带编码增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的嵌合腺病毒载体（Ad5/35）进行转导，不需要任何体外程序和使用培养基物质，如抗生素和动物来源的生物材料。在静脉注射基因修饰的浓缩白细胞液1周后，在挫伤脊髓中发现了产生增强型绿色荧光蛋白的白细胞。在此基础上，Islamov等还在既往研究中，将这种串联输送编码血管内皮生长因子（VEGF）、胶质细胞系神经营养因子（GDNF）和神经细胞粘附分子（NCAM）的治疗性基因的策略与多点转位硬膜外电刺激相结合，并证明了基因治疗和电疗相结合对SCI小型猪的积极作用。然而，在联合方法中，细胞介导的基因治疗对创伤后脊髓恢复的影响并不明显。Islamo等在发表于《中国神经再生研究（英文版）》杂志2023年7期的研究中，为了提高白细胞转导的有效性，使用了一种嵌合腺病毒载体（Ad5/35）；并在动物选择方面使用了生理和生物化学特征与人类相近的大型动物—小型猪，以评估静脉注射同时产生重组VEGF、GDNF和NCAM的自体富含基因的浓缩白细胞对挫伤脊髓组织重塑的作用。结果发现自体富含基因的浓缩白细胞减少了脊髓组织中抑制再生的囊性空洞和胶质瘢痕，提高了脊髓细胞的存活率，促进了轴突的重新生长和提高了髓鞘细胞数量，这与行为表现的改善是一致的。这项工作为脊髓损伤的新基因疗法开发提供了新思路。