构建人视网膜源性神经营养因子3真核表达质粒的技术突破

doi:10.3969/j.issn.1673-5374.2013.11.009

摘要/Abstract

摘要：

神经营养因子3对中枢神经系统和视网膜损伤修复具有显著的促进作用。以往报道多为神经营养因子3病毒表达载体，而质粒载体比病毒更安全，更容易用到临床研究。实验将获得的人视网膜神经营养因子3 DNA与带绿色荧光蛋白标记的真核表达质粒pEGFP-N1重组中构建pEGFP-N1-NT-3表达质粒，然后将其转染至293T细胞中，48h后转染效率达到50.06±2.78%。荧光显微镜观察可见细胞中大量表达NT-3-GFP，表明构建的pEGFP-N1-NT-3能表达和分泌高水平的神经营养因子3。激光扫描共聚焦显微镜进一步观察，NT-3-GFP在293T细胞恒定位置上形成分泌泡，说明神经营养因子3在真核细胞中的表达符合细胞内分泌蛋白的生理合成过程。Western-blot检测显示在约56kDa出现前体NT-3-GFP，进一步验证了NT-3-GFP在细胞内的表达。转染后48h后酶联免疫吸附试验细胞培养液发现神经营养因子3的浓度为22.3ng/mL，说明所构建的真核质粒质粒可以高效表达分泌神经营养因子3，证明该方法可有效构建人视网膜源性神经营养因子3真核表达质粒，并能成功表达神经营养因子3。

关键词: 神经再生, 因治疗, 物因子, 经营养因子3, 粒, 合蛋白, 胞胞囊技术, 网膜色素变性, 金资助文章

Abstract:

Neurotrophin-3 (NT-3) can promote the repair of central nervous system and retinal damage. In previous reports, NT-3 has been expressed by viral vectors. However, plasmid vectors have a safer profile compared with viral vectors in clinical studies. This study recombined amplified human retinal NT-3 with a eukaryotic expression plasmid containing green fluorescent protein (GFP) to construct an NT-3 expression plasmid, pEGFP-N1-NT-3. The transfection efficiency 48 hours after pEGFP-N1-NT-3 transfection to 293T cells was 50.06 ± 2.78%. Abundant NT-3-GFP was expressed in 293T cells as observed by fluorescence microscopy, suggesting the construct pEGFP-N1-NT-3 effectively expressed and secreted NT-3-GFP. Secretory vesicles containing NT-3-GFP were observed in a constant location in cells by laser scan confocal microscopy, indicating the expression and secretion processes of NT-3 in eukaryotic cells were in accordance with the physical synthesis processes of secreted proteins. Western blot assay showed that pro-NT-3-GFP had a molecular weight of 56 kDa, further confirming NT-3-GFP expression. At 48 hours after transfection, the concentration of NT-3 in culture medium was 22.3 ng/mL, suggesting NT-3 produced by pEGFP-N1-NT-3 was efficiently secreted. This study constructed a human retinal-derived NT-3 eukaryotic expression plasmid that efficiently expressed and secreted NT-3.

Key words: neural regeneration, ene therapy, biological factor, eurotrophin-3, lasmid, usion protein, ncapsulated cell technology, etinitis pigmentosa, rants-supported paper, euroregeneration

. 构建人视网膜源性神经营养因子3真核表达质粒的技术突破[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2013, 8(11): 1031-1040.

Chunxia Peng, Xiaobei Yin, Mengda Li, Ting He, Genlin Li. Construction of a eukaryotic expression plasmid for human retina-derived neurotrophin-3[J]. Neural Regeneration Research, 2013, 8(11): 1031-1040.

参考文献

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

1. 中文摘要：

自人视网膜组织提取扩增出神经营养因子3的DNA，与pEGFP-N1重组构建NT-3- GFP融合蛋白的表达质粒pEGFP-N1-NT-3。将其转染到293T细胞后24，48h，通过荧光显微镜观察其转染率分别为17.56%，46.76%。通过激光扫描共聚焦显微镜观察在293T细胞质内表达的NT-3-GFP融合蛋白形成分泌囊泡，分泌蛋白细胞内合成的生理过程。转染后48h，Western blot检测细胞中见前体NT-3-GFP融合蛋白的表达的条带。所构建的pEGFP-N1-NT-3的神经营养因子3表达质粒可以高效率地表达并分泌神经营养因子3，为研究神经营养因子3对视网膜神经细胞的长期保护作用提供了技术保证。

2. 文章重点内容的中文介绍：

细胞胞囊技术既可使细胞持续表达的蛋白因子有效的释放，又可保护细胞免受免疫系统的攻击。神经营养因子3对中枢神经系统和视网膜损伤具有显着的促进作用。以细胞胞囊技术为基础的神经营养因子3释药系统可以在中枢神经系统和眼球内发挥可控制的、持续、长期的作用，为治疗中枢神经系统疾病及视网膜色素变性治疗带来希望。而人神经营养因子3表达载体构建是制作以细胞胞囊技术为基础的神经营养因子3释药载体的关键。实验从人视网膜组织中反转录PCR方法提取并扩增出人的NT-3 DNA，与带绿色荧光蛋白标记的真核表达质粒pEGFP-N1重组构建人神经营养因子3的真核表达载体pEGFP-N1-NT-3。将其转染到人胚肾细胞系293T细胞中，293T细胞转染后24，48h，荧光显微镜下见大量NT-3-GFP表达，Image-Pro Plus6.0图象分析软件计数细胞转染率，24，48h分别为17.56%，46.76%。激光扫描共聚焦显微镜进一步观察，NT-3-GFP在293T全细胞表达，并在细胞质恒定位置上形成分泌泡，说明神经营养因子3在真核细胞中的表达符合细胞内分泌蛋白的生理合成过程。转染后48h收集细胞进行Western blot检测显示：在约56kDa出现前体NT-3-GFP（前体NT-3：30kDa+GFP：27kDa=57kDa），进一步验证了NT-3-GFP在细胞内的表达。转染后48h收集细胞培养液，ELISA检测神经营养因子3的浓度为22ng/mL，这说明所构建的质粒可以高效表达分泌神经营养因子3，进一步验证将所构建质粒pEGFP-N1-NT-3与细胞胞囊技术联合构建以细胞胞囊技术为基础的神经营养因子3长效释药载体的可行性。为研究神经营养因子3对中枢神经系统及视网膜色素变性治疗提供技术支持。

3. 实验设计：

(1)自人视网膜组织提取总RNA。

(2)以所提的总RNA为模板，采用反转录PCR方法扩增出神经营养因子3 DNA，通过TA克隆继续扩增并测序神经营养因子3 DNA。

(3)将扩增得到的神经营养因子3 DNA与真核表达质粒pEGFP-N1重组，神经营养因子3的表达载体pEGFP-N1-NT-3。

(4)将pEGFP-N1-NT-3转染到293T细胞，观察转染效率及表达情况。同时检测神经营养因子3在培养液中的分泌量。

4.文章构思：

实验是系列研究中的一部分，前期的研究已经证明神经营养因子3对体外培养视网膜神经细胞的损伤有保护作用，动物体内实验也证明神经营养因子3对视网膜色素变性动物模型rd小鼠的视网膜神经细胞有重要的保护作用。但是视网膜色素变性及神经系统性疾病大都是慢性病，病程长。而位置比较特殊，全身用药难以到达。所以我们想到构建神经营养因子3的长效释药载体，以细胞胞囊技术为基础的神经营养因子3长期释药载体。构建人神经营养因子3的真核表达质粒是组装以细胞胞囊技术为基础的神经营养因子3长期释药载体的关键，也实验研究的主要内容。
5. 课题设计中区别于以往相关研究的特点：

(1)在课题设计中采用人源性神经营养因子3 DNA 区别以往动物源性，有利于用于临床研究。

(2)实验采用质粒作为表达载体，比以往研究用病毒为载体，更安全。在实验方法上本实验采用TA克隆，更容易获得高浓度DNA片段，增加重组效率。在神经营养因子3 DNA 起始密码子前加Kozak序列，增加了神经营养因子3表达。并采用多种方法从表达组织学形态，到细胞内蛋白表达及细胞外分泌都做了客观定量的观察。

6. 文章学术水平与国内外同类研究的比较：

文章依据实验所得的数据撰写，与国内外同类研究比较：报道的成功构建人神经营养因子3 真核质粒表达载体，而以往报道多是神经营养因子3病毒表达载体，质粒载体比病毒更安全，更容易用到临床研究。其次描述的方法合理，采用激光扫描共聚焦显微镜、Western blot，ELISA等方法对所构建质粒在真核细胞中转染效率、表达组织形态学特征、细胞内表达及细胞外分泌都做了定量检测，得出翔实可靠结果，这是同类研究中未曾见到。最后所研究的构建神经营养因子3质粒表达载体与细胞胞囊技术技术结合，未见同类研究的报道。

7.创新性分析：

检索时间：2012-09-06

检索范围：收录在PubMed的所有文献

检索关键词：NT-3 expression vector

检索出文章数量：49篇

以“NT-3 expression vector”为检索词，在PubMed检索到49篇相关文献，与实验相比较。以往研究中多用的病毒载体作为神经营养因子3的表达载体，质粒作为表达载体的仅有2篇报道。病毒载体有高转染的优点，但有扩散及免疫毒性反应，将来用到临床研究及应用上性差。实验选择pEGFP-N1作为表达载体与以往质粒表达载体相比较，带有绿色荧光蛋白标记有利于研究中观察。在插入DNA片段前加Kozak序列增强了蛋白表达。而且观察到NT-3-GFP融合蛋白在真核细胞内表达及分泌、形成分泌囊泡的微观形态，验证了重组蛋白在真核细胞表达近似自然，在检索文献中未见报道。

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