分离自器官型神经球的BMPRII+神经前体细胞及其特征：人类胎儿脊髓发育的体外模型

doi:10.4103/1673-5374.373669

摘要/Abstract

摘要：

在脊髓发育过程中，顶板分泌的骨形态发生蛋白定向了感觉神经元的命运，包括上行感觉柱的形成，尽管它们的生物学特性还不是很清楚。II型骨形态发生蛋白受体是同源受体，在胚胎发育过程中由神经前体细胞表达；然而，从胎儿脊髓中富集II型骨形态发生蛋白受体阳性神经前体细胞的体外方法并不存在。免疫荧光检测发现，II型骨形态发生蛋白受体免疫荧光表达最高的区域定位在胎龄2个月的胎儿脊髓感觉柱上。在完整的胎儿脊髓和皮质中，CD34/CD39共定位检测确定了实质和脑膜相关的II型骨形态发生蛋白受体阳性血管细胞。白血病抑制因子免疫染色确定了集中在背角和腹角神经元中的体细胞群。白血病抑制因子补充和高密度培养相结合，使培养物生长传代超过10代，同时协同增加了具有分层细胞结构的神经球的比例。这些神经球的特点是II型骨形态发生蛋白受体+/MAP2ab+/–/βIII-tubulin+/nestin–/vimentin–/GFAP–/NeuN–神经前体细胞围绕着βIII-管蛋白+/nestin+/vimentin+/GFAP+/MAP2ab-/NeuN-多能前体的异质核心。源自三潜能神经球的分离培养物含有神经元（βIII-管蛋白+）、星形细胞（GFAP+）和少突胶质细胞（O4+）谱系细胞。荧光激活细胞分选筛选的II型骨形态发生蛋白受体阳性神经前体细胞是MAP2ab+/–/βIII-tubulin+/GFAP–/O4– 。这是首次在人类胎儿脊髓中分离出的II型骨形态发生蛋白受体阳性神经前体细胞，并对其进行了定性。结果显示，白血病抑制因子与高密度再聚集培养物协同作用，支持神经球的器官型重组，由表面II型骨形态发生蛋白受体阳性神经前体细胞表征。实验提供的体外模型能够扩增10代以上的人类胎儿脊髓细胞数量。II型骨形态发生蛋白受体在脊髓发育中的作用的研究主要依赖于小鼠和大鼠模型，通过推断得出人类发育的特性。由于小鼠生物学和人类之间的显著物种差异，包括中枢神经系统结构的解剖差异，在小鼠模型中的发现不能被认为适用于人类脊髓发育。出于这些原因，实验中的体外模型为更好地理解神经发育途径提供了一种新的工具，包括骨形态发生蛋白信号，以及脊髓损伤研究和药物治疗测试。

https://orcid.org/0000-0001-8733-2654 (Michael W. Weible II); https://orcid.org/0000-0002-8225-3671 (Tailoi Chan-Ling)

Abstract: Roof plate secretion of bone morphogenetic proteins (BMPs) directs the cellular fate of sensory neurons during spinal cord development, including the formation of the ascending sensory columns, though their biology is not well understood. Type-II BMP receptor (BMPRII), the cognate receptor, is expressed by neural precursor cells during embryogenesis; however, an in vitro method of enriching BMPRII+ human neural precursor cells (hNPCs) from the fetal spinal cord is absent. Immunofluorescence was undertaken on intact second-trimester human fetal spinal cord using antibodies to BMPRII and leukemia inhibitory factor (LIF). Regions of highest BMPRII+ immunofluorescence localized to sensory columns. Parenchymal and meningeal-associated BMPRII+ vascular cells were identified in both intact fetal spinal cord and cortex by co-positivity with vascular lineage markers, CD34/CD39. LIF immunostaining identified a population of somas concentrated in dorsal and ventral horn interneurons, mirroring the expression of LIF receptor/CD118. A combination of LIF supplementation and high-density culture maintained culture growth beyond 10 passages, while synergistically increasing the proportion of neurospheres with a stratified, cytoarchitecture. These neurospheres were characterized by BMPRII+/MAP2ab+/–/βIII-tubulin+/nestin–/vimentin–/GFAP–/NeuN– surface hNPCs surrounding a heterogeneous core of βIII-tubulin+/nestin+/vimentin+/GFAP+/MAP2ab–/NeuN– multipotent precursors. Dissociated cultures from tripotential neurospheres contained neuronal (βIII-tubulin+), astrocytic (GFAP+), and oligodendrocytic (O4+) lineage cells. Fluorescence-activated cell sorting-sorted BMPRII+ hNPCs were MAP2ab+/–/βIII-tubulin+/GFAP–/O4– in culture. This is the first isolation of BMPRII+ hNPCs identified and characterized in human fetal spinal cords. Our data show that LIF combines synergistically with high-density reaggregate cultures to support the organotypic reorganization of neurospheres, characterized by surface BMPRII+ hNPCs. Our study has provided a new methodology for an in vitro model capable of amplifying human fetal spinal cord cell numbers for > 10 passages. Investigations of the role BMPRII plays in spinal cord development have primarily relied upon mouse and rat models, with interpolations to human development being derived through inference. Because of significant species differences between murine biology and human, including anatomical dissimilarities in central nervous system (CNS) structure, the findings made in murine models cannot be presumed to apply to human spinal cord development. For these reasons, our human in vitro model offers a novel tool to better understand neurodevelopmental pathways, including BMP signaling, as well as spinal cord injury research and testing drug therapies.

Key words: BMPRII, bone morphogenetic protein, histotypic, human spinal cord development, leukemia inhibitory factor, neurosphere, organotypic, , reaggregate, sensory columns

. 分离自器官型神经球的BMPRII+神经前体细胞及其特征：人类胎儿脊髓发育的体外模型[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2024, 19(2): 447-457.

Michael W. Weible II, Michael D. Lovelace, Hamish D. Mundell, Tsz Wai Rosita Pang, Tailoi Chan-Ling. BMPRII+ neural precursor cells isolated and characterized from organotypic neurospheres: an in vitro model of human fetal spinal cord development[J]. Neural Regeneration Research, 2024, 19(2): 447-457.

参考文献

引言

出版重点

《中国神经再生研究（英文版）》杂志为SCI、PubMed数据库收录的国际唯一一本专注神经再生领域研究的经同行评议的开放获取期刊，出版来自全球神经再生领域专业学者的前沿性基础研究及临床研究及转化医学、循证医学优秀的最新成果。

期刊出版来自于脑损伤与神经再生、脊髓损伤与神经再生、周围神经损伤与神经再生和神经退行性病与神经再生、神经影像与神经再生的相关研究。期刊关注神经损伤与再生过程中的轴突再生、突触生长、神经可塑性、神经修复和替代、神经移植等最新研究成果。尤其关注应用细胞治疗、基因治疗、生物因子治疗、药物治疗、手术治疗、康复治疗、物理疗法、组织工程、生物工程、生物材料、神经假体等干预性方法产生神经再生效果的相关研究。文章应清晰描述抑制神经元损伤、减轻神经元损伤的一系列变化，保护损伤神经元的过程、方法、程度与评价，突出从细胞分子水平以及分子生物学水平解释神经元损伤后以及预后再生的机制。

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延伸阅读

NRR：悉尼大学Tailoi Chan-Ling团队找到用于理解脊髓神经发生的新工具

在脊髓神经发生过程中，顶板的骨形态发生蛋白（BMP）的背侧分泌作用于脊髓祖细胞，以维持和调节神经管中的干细胞池。BMP途径中的信号传导始于BMP-2，4，6或7配体与II型受体（BMPRII）的结合，导致BMP I型受体的募集和磷酸化。激活的BMPRI磷酸化特定的Smads（一个转录调节因子家族），介导BMP的下游信号效应，包括神经管背中央模式期间的细胞命运。

白血病抑制因子（LIF）是另一种高度多效性信号肽，属于白介素-6细胞因子家族。所有家族成员都激活信号转导子和转录激活子3（STAT3），这是一种影响神经干细胞增殖、谱系和迁移的转录因子。与它的同源受体LIF受体/CD118结合，招募另一种受体糖蛋白130（gp130）形成异二聚体。二聚化后，受体招募并激活Janine激酶（JAK）家族成员，进而磷酸化STAT并二聚化，然后转移到靶基因受转录调控的细胞核。

BMPRII和LIF暴露的影响往往是细微差别的，不一定适合体内实验。例如，BMP受体的预先激活对LIF反应性至关重要，并通过下游形成由p300桥接的STAT3-Smad1复合物来与LIF协同作用，以诱导GFAP表达。澳大利亚悉尼大学Tailoi Chan-Ling先前对人类脊髓神经前体培养物的体外研究表明，LIF和外源性BMP4协同促进星形胶质细胞谱系发育。在发育的大鼠前脑中，LIF通过JAK/STAT途径作用于桡神经胶质细胞，以促进对神经胶质谱系的作用，而BMP2信号下调相同的神经胶质限制性前体抗原A2B5/4D4，并促进神经元限制性前前体标记物的表达。因此，BMP/LIF对分化的影响可能是前体细胞类型和CNS区域依赖性的。

迄今为止，大多数研究BMPRII在神经系统发育中的作用的研究都使用了小鼠和大鼠模型，并且有充分证据表明，源自小鼠和人类模型的神经干细胞之间存在显著差异。除了中枢神经系统结构的广泛神经解剖学差异外，如果没有进一步的研究，这些发现也不能被认为适用于人类脊髓发育的研究。

澳大利亚悉尼大学Tailoi Chan-Ling的研究团队在发表于《中国神经再生研究（英文版）》2024年第2期的研究通过器官型神经球的形成，更准确地反映体外早期人类神经发育过程。其假设LIF治疗可以改变神经球的细胞结构，这是由于其已知的促迁移效应和与BMP配体和受体的协同信号传导。目前，尚未见描述BMPRII在发育中的人类胎儿脊髓中定位的研究。

Tailoi Chan-Ling等的研究首次在人类胎儿脊髓中分离出BMPRII+NPCs，并对其进行了定性。结果显示，LIF与高密度再聚集培养物协同作用，支持神经球的器官型重组，由表面BMPRII+ NPCs表征。实验提供的体外模型能够扩增10代以上的人类胎儿脊髓细胞数量。BMPRII在脊髓发育中的作用的研究主要依赖于小鼠和大鼠模型，通过推断得出人类发育的特性。实验中的体外模型为更好地理解神经发育途径提供了一种新的工具，包括BMP信号，以及脊髓损伤研究和药物治疗测试。