1 实验设计构思介绍
缺血性中风作为卒中的主要类型，其高发病率、高死亡率、高致残率使其成为世界范围危害极大、亟待攻克的一种疾病。寻找一种有效的、副作用小、易被患者接受及长期应用的脑缺血防治方法无疑具有十分重要的意义。穴位敷贴临床应用于脑缺血的防治疗效确切，但目前缺乏对其作用机制的研究。故本课题在以往研究工作的基础上，(1)将长期应用于临床脑缺血防治的经典方剂——“安宫牛黄丸”中的效应物质进行提取纯化，利用现代促透剂技术，制备中药透皮吸收新型制剂，采用目前国际上重点开发的给药途径——穴位敷贴法，能够更好地适应临床脑缺血防治。(2)采用免疫组化等技术，以凋亡调控基因P53、Bcl-2、Bax为切入点，研究穴位敷贴对脑缺血神经元凋亡的调控作用，旨在揭示其对缺血性脑损伤的神经保护作用及其机制，为开发防治脑缺血的新型穴位敷贴制剂提供理论依据。
2 国内外同类研究水平的介绍
目前国内外关于穴位敷贴治疗脑缺血的疗效机制研究尚少，仅有少量相关研究证实穴位敷贴能降低缺血性脑损伤脑水肿程度、提高纤溶酶活性、抗凝血、抗自由基损伤，具有脑保护作用。
3 与其他同类研究的比较
本研究将长期应用于临床脑缺血防治的经典方剂——“安宫牛黄丸”中的效应物质进行提取纯化，利用现代促透剂技术，制备中药透皮吸收新型制剂，采用目前国际上重点开发的给药途径——穴位敷贴法，能够更好地适应临床脑缺血防治。并采用免疫组化等技术，以凋亡调控基因Bcl-2、Bax、P53为切入点，证实了安宫牛黄贴穴位敷贴对脑缺血大鼠神经元凋亡的调控作用及机制，说明了其与电针比较的优势所在，与同类研究比较，具有一定的先进性。
4 本文先进性
（1）本研究在安宫牛黄贴的制备及应用方面具有创新性：将长期应用于临床脑缺血防治的经典方剂——“安宫牛黄丸”中的效应物质进行提取纯化，利用现代促透剂技术，制备中药透皮吸收新型制剂，采用目前国际上重点开发的给药途径——穴位敷贴法，能够更好地适应临床脑缺血防治。
在检索范围内，国内见有探讨中药穴位敷贴治疗大鼠脑缺血的研究报道，国内外未见有将安宫牛黄贴（郁金提取物、盐酸小蘗碱、黄芩苷、栀子苷、冰片、麝香）应用于脑缺血防治的研究。检索内容详见下文查新报告。
（2）本研究在穴位敷贴对脑缺血的疗效机制研究方面具有先进性：采用免疫组化等技术，以凋亡调控基因P53、Bcl-2、Bax为切入点，研究穴位敷贴对脑缺血神经元凋亡的调控作用，旨在揭示其对缺血性脑损伤的神经保护作用及其机制，为开发防治脑缺血的新型穴位敷贴制剂提供理论依据。
在检索范围内，国内见有探讨穴位敷贴对脑缺血保护作用的研究报道，国内外未见有探讨穴位敷贴对脑缺血凋亡调控基因P53、Bcl-2、Bax影响的研究。检索内容详见下文查新报告。
（3）查新报告
查新咨询要点：本文拟探讨安宫牛黄贴（郁金提取物、盐酸小蘗碱、黄芩苷、栀子苷、冰片、麝香）穴位敷贴对脑缺血大鼠海马CA1区Bcl-2 、Bax、P53蛋白表达的影响。
检索情况：
检索中国知网（CNKI）、维普中文数据库、万方数据库、现刊其其他：中国中国急症中医外治杂志 中国中医药信息杂志等期刊2012年部分现刊、pubmed。
检索用词：中文：1、脑缺血2、穴位敷贴or 穴位贴敷3、郁金提取物and 盐酸小蘗碱and 黄芩苷and 栀子苷and 冰片and 麝香 4 神经元凋亡or细胞凋亡 5 Bcl-2 or P53 or Bax
英文：cerebral ischemia point application Bcl-2 P53 Bax apoptosis
检索策略：①1and2 ②1and 3 ③2 and 4 ④2 and 5
检索结果：检索文献总量：31553493+ 检出文献量：28 密切相关文献量：8
密切相关文献目录：
1) 李春红,等.舒愈膏穴位贴敷治疗缺血性中风临床研究.中国中医急症,2010;(1):19,81
2) 李连涛,等.温养通络敷贴对脑缺血脑卒中的疗效观察.中医外治杂志.2004,13(3):34-35
3) 杨洁红,白海波,万海同,蔡宇.川芎提取物穴位敷贴对脑缺血再灌注损伤大鼠t-PA 与PAI 活性的影响.中国医药学报,2004,19(9):526—527
4) 杨洁红,白海波,万海同,蔡宇.川芎提取物穴位敷贴对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用.中国中医药信息杂志,2004,11(9):778—779
5) 杨洁红,白海波,蔡宇,万海同.川芎提取物穴位敷贴对大鼠脑缺血脑含水量和脑指数的影响.江苏中医药,2005,26(10):65—67
6) 杨洁红,等.川芎提取物穴位敷贴对大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血的保护作用.中国中医急症,2004,19（9）：526—528
7) 张东淑,卢永康,苏子仁,蔡大可.“化瘀贴”穴位敷贴对局灶性脑缺血大鼠VEGF表达的影响.中国针灸,2009；29（3）：217-221
8) 黄芳,等.穴位敷贴对脑缺血中风肢体偏瘫患者的疗效观察.中华现代护理学杂志,2008,5(7):599-600
查新结论：
缺血性中风为临床常见病、多发病，50—70%的存活者遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来严重负担。穴位敷贴疗法治疗本病有着独特的优点。
国内山东的李春红等[1]观察舒愈膏（处方组成为黄芪、川芎、赤芍、地龙、水蛭、当归、胆南星、冰片等）穴位贴敷治疗缺血性中风的临床疗效。将90例患者随机分为3组，常规治疗组与西医常规治疗，电针组、穴位敷贴组在常规治疗基础上分别予以电针、舒愈膏贴敷治疗，均以4周为一个疗程。结果：电针组、舒愈膏组临床疗效均优于常规治疗组，两组治疗后NIHSS评分、Barthel指数与常规治疗组比较均有统计学差异，电针组与舒愈膏组比较无统计学意义。结论：舒愈膏穴位敷贴治疗缺血性中风有良好的临床疗效。山东的李连涛等[2]观察温养通络敷贴（药物组成红参、黄芪、水蛭、土元、桂枝、苏和香）对脑缺血脑卒中（气虚血瘀型）患者治疗效果，探讨温养通络敷贴的治疗机制。临床诊断为缺血性脑卒中恢复期患者60例，随机分为阿司匹林组（对照组）和阿司匹林加温养通络敷贴组（治疗组），每组各30例，观察2组患者在用药前后临床症状和血小板活化因子的变化。结果：治疗组患者治疗后症状明显改善，血小板活化因子浓度明显下降。结论：温养通络敷贴能有效改善临床症状，降低血小板活化因子的浓度。浙江的杨洁红等[3]观察川芎提取物穴位敷贴组对组织型纤溶酶原激活物（t-PA）与组织型纤溶酶原激活抑制物（PIA）活性的影响。采用四血管阻断法制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型，测定血浆t-PA、PAI活性。结果：川芎提取物穴位敷贴可使血浆中t-PA活性升高，PAI活性下降，调节t-PA、PAI活性比例。结果表明川芎提取物穴位敷贴具有提高纤溶活性、溶栓消栓作用。
本项目拟探讨安宫牛黄贴穴位敷贴对脑缺血大鼠海马CA1区Bcl-2、Bax 、P53蛋白表达的影响，在检索范围内，国内见有探讨中药穴位敷贴治疗大鼠脑缺血的研究报道，国内外未见有探讨安宫牛黄贴（郁金提取物、盐酸小蘗碱、黄芩苷、栀子苷、冰片、麝香）穴位敷贴对脑缺血大鼠海马CA1区Bcl-2、Bax 、P53蛋白表达影响的研究报道。
5 专家意见与答疑
专家意见1：实验与方法叙述简练、清晰，但是对药物制备过程不够详细，在做机制探讨时，仅用免疫组化很难说明问题，选择因子太少，机制探讨方面显得深度不够。
作者答疑：关于药物制备过程不够详细：由于本药物及制备方法正在申请专利，因涉及部分保密内容，故药物、基质比例，详细制备方法未在文中尽述。
关于机制探讨中仅涉及免疫组化指标问题：①目前国内外关于穴位敷贴对脑缺血疗效机制方面的研究较少，仅有少量相关研究证实穴位敷贴能降低缺血性脑损伤脑水肿程度、提高纤溶酶活性、抗凝血、抗自由基损伤，具有脑保护作用。我们结合前期研究基础，采用免疫组化方法，以凋亡调控基因Bcl-2、Bax、P53为切入点，观察安宫牛黄贴穴位敷贴对局灶性脑缺血大鼠细胞凋亡调控基因的作用，从而探讨其对脑缺血的保护作用及机制。②本课题组正在进行进一步的相关研究：本课题组对穴位敷贴对脑缺血的保护作用进行了大量的研究，从临床研究，到基本的药理、毒理学实验，再到采用免疫组化、免疫荧光等技术，进一步深入探讨其疗效机制，目前相关研究正在陆续进行中。
专家意见2：文章立论不清，是想说明“贴剂与口服药物之间的药效不同，还是探讨与电针疗法的相关性或替代方法？虽然想从机制上做讨论，但又未涉及贴剂与细胞凋亡之间，尤其是与神经细胞之间的密切关系，未见参考文献或相关数据。此外就贴剂给药部位为中医药传统穴位也无准确的国际公认的专业术语描述，给药剂量是依据口服？注射？如何折算高中低的，还是有其他方式，可信性、可行性待考证。文中参考文献数量过少，与前人及国外相关研究内容相关性不祥。
作者答疑：①关于立论：本文主要探讨安宫牛黄贴穴位敷贴应用于脑缺血防治与电针比较的优势所在，这在实验设计（电针组为对照组）及实验结果、讨论（比较电针组与穴位敷贴组的结果证实安宫牛黄贴穴位敷贴在调控凋亡基因方面与电针疗效相当或优于电针组，且使用方便，更适合临床长期应用）中有所体现。②关于机制探讨：本文主要探讨穴位敷贴对大鼠脑缺血后Bcl-2、Bax及P53蛋白表达的影响，从而说明穴位敷贴的神经保护作用；关于穴位敷贴与神经细胞的关系，我们在以往的研究中已经证实，（张东淑,卢永康,等.“化瘀贴”穴位敷贴对局灶性脑缺血大鼠VEGF表达的影响.中国针灸,2009；29（3）：217-221）穴位敷贴可促进内皮细胞的增殖与迁移，使缺血区神经细胞数量显著增加。这在引言中有提到。③关于给药穴位：“大椎”（DU14）、“气海”（RN6）、“命门”（DU4）穴参照新世纪全国高等中医药院校规划教材《实验针灸学》常用实验动物针灸穴位。参照专家意见，在中文稿中加入穴位国际名称。④关于给药剂量：大鼠给药剂量等效量是依据体表面积换算人按照临床穴位敷贴常用量：3g/70kg，换算为大鼠等效量为：0.27g/kg，以等效量的5倍量作为低剂量组（考虑到动物穴位敏感度、穴位给药吸收情况，此剂量更适合动物给药）：1.35g/kg为低剂量，中剂量：2.7g/kg，高剂量：5.4g/kg。⑤关于参考文献：国内外关于穴位敷贴对脑缺血临床与机制研究均较少，仅有少量相关研究证实穴位敷贴能降低缺血性脑损伤脑水肿程度、提高纤溶酶活性、抗凝血、抗自由基损伤，具有脑保护作用。根据专家意见，已修改和补充了相关参考文献。
