丹参多酚酸盐干预脑缺血再灌注大鼠热休克蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.1673-5374.2013.25.003

摘要/Abstract

摘要：

实验采用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型，并于再灌注后0，24，48 h向大鼠腹腔注射主要成分为丹酚酸B的丹参多酚酸盐18 mg/kg，观察其神经保护作用。再灌注后72 h，神经功能缺损评分结果显示应用丹参多酚酸盐干预的大鼠神经功能显著改善。取大鼠缺血脑组织检测发现，丹参多酚酸盐干预的模型大鼠脑梗死体积明显减小，脑组织损伤程度明显减轻，凋亡细胞明显减少。进一步对缺血脑组织热休克蛋白22和蛋白激酶B的表达进行检测发现，模型组和丹参多酚酸盐组缺血脑组织热休克蛋白22和磷酸化蛋白激酶B表达明显增高，以丹参多酚酸盐组增高更明显，而蛋白激酶B表达在各组间差异无显著性意义。结果提示丹参多酚酸盐可通过提高缺血脑组织热休克蛋白22和磷酸化蛋白激酶B的表达发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

关键词: 神经再生, 中医药, 脑损伤, 丹酚酸B, 丹参多酚酸盐, 热休克蛋白22, 蛋白激酶B, 缺血再灌注脑损伤, 凋亡, 神经保护

Abstract:

Stroke remains a worldwide health problem. Salvianolate exerts a protective effect in various mi-crocirculatory disturbance-related diseases, but studies of the mechanisms underlying its protective action have mainly focused on the myocardium, whereas little research has been carried out in brain tissue following ischemia-reperfusion. We assessed the neuroprotective effects of salvianolate in a rat model of cerebral ischemia-reperfusion injury induced using the suture method. At onset and 24 and 48 hours after reperfusion, rats were intraperitoneally injected with salvianolate (18 mg/kg) or saline. Neurological deficit scores at 72 hours showed that the neurological functions of rats that had received salvianolate were significantly better than those of the rats that had received saline. 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride was used to stain cerebral tissue to determine the extent of the infarct area. A significantly smaller infarct area and a significantly lower number of apoptotic cells were observed after treatment with salvianolate compared with the saline treatment. Expression of heat shock protein 22 and phosphorylated protein kinase B in ischemic brain tissue was significantly greater in rats treated with salvianolate compared with rats treated with saline. Our findings suggest that salvianolate provides neuroprotective effects against cerebral ischemia-reperfusion injury by upregulating heat shock protein 22 and phosphorylated protein kinase B expression.

Key words: neural regeneration, traditional Chinese medicine, brain injury, salvianolic acid B, salvianolate, heat shock protein 22, protein kinase B, cerebral ischemia-reperfusion injury, apoptosis, neuroprotection, neuroregeneration

. 丹参多酚酸盐干预脑缺血再灌注大鼠热休克蛋白的表达[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2013, 8(25): 2327-2335.

Jinnan Zhang, Wei Lu, Qiang Lei, Xi Tao, Hong You, Pinghui Xie. Salvianolate increases heat shock protein expression in a cerebral ischemia-reperfusion injury model[J]. Neural Regeneration Research, 2013, 8(25): 2327-2335.

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1 文章重点内容介绍：

缺血后处理面临着对已经严重缺血器官进行多次短时缺血再灌注操作可能性和再灌注是否及时等问题，由于目前医疗条件的限制，缺血后处理在实际临床应用中存在很大限制。所以，使用药物作为干预措施实现缺血后处理保护缺血组织对于临床治疗显得尤为重要。近些年，药物后处理对缺血再灌注的保护作用正逐渐被探索。丹酚酸B对心肌保护作用已经得到肯定，其高纯度注射制剂丹参多酚酸盐作为心肌梗死后干预用药，目前已广泛应用于临床治疗。目前对于丹酚酸B对缺血再灌注组织保护作用具体机制研究绝大多数仍集中在心肌方面，对于脑缺血再灌注研究较少。丹酚酸B能够减小TTC染色梗死体积，减少TUNEL阳性凋亡细胞产生，降低神经功能缺损评分，促进功能恢复。丹参多酚酸盐干预对抗细胞凋亡是其实现脑缺血再灌注神经保护作用的可能机制之一。神经细胞的死亡分为坏死及凋亡两个过程。其中细胞凋亡是迟发型死亡的重要通路，在脑缺血再灌注中起着重要作用。凋亡是导致再灌注损伤重要病理形式之一。通过干预增加蛋白激酶B（AKT）活性，减少再灌注细胞凋亡有助于减轻再灌注后的损伤，保持细胞功能和促进细胞功能的恢复。丹酚酸B干预能够增加磷酸化AKT表达，即增加AKT活性。

热休克蛋白是细胞在高温、多种理化及生物应激原作用下表达增多的一组蛋白质。既往研究显示，在缺血、缺氧损伤、冬眠和压力负荷损伤里，热休克蛋白22可激活细胞内AMP蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶/AKT、蛋白激酶C等信号通路，对各种应激损伤发挥保护作用。热休克蛋白22在神经系统疾病发生发展中有着非常重要的作用。近些年，热休克蛋白22在缺血再灌注领域的作用被广泛关注。热休克蛋白22在心肌缺血再灌注中有着保护作用。热休克蛋白22在脑缺血再灌注领域研究很少。实验中丹酚酸B干预能够明显增加热休克蛋白22表达，可能通过热休克蛋白22的分子伴侣、稳定线粒体功能及抗细胞凋亡等作用实现神经保护作用。综上所述得到结论，在大鼠脑缺血再灌注后给予丹参多酚酸盐干预能够减小梗死面积，改善组织病理变化维持细胞活性，减少凋亡细胞的产生，促进动物运动功能的恢复，改善动物脑梗死预后，丹参多酚酸盐对脑缺血再灌注具有明显的保护作用。丹参多酚酸盐发挥神经保护作用是通过增加热休克蛋白22及磷酸化AKT表达，发挥热休克蛋白22及AKT抗细胞凋亡、防止变异蛋白聚集、维持线粒体完整性，减少细胞凋亡级联物质释放等作用实现的。

2 实验设计及文章构思：

建立大鼠脑缺血再灌注模型，缺血2h后恢复血流灌注72h后断头取脑，其中假手术组仅分离血管并拴线不进入颈总动脉分叉处，并与干预组在相同时间点腹腔注射等量生理盐水，缺血再灌注组进行大脑中动脉栓塞，并也给予等量生理盐水腹腔注射，干预组在再灌注开始时即给予丹参多酚酸盐腹腔注射并于再灌注后24，48h分别再次给予丹参多酚酸盐，至72h断头取脑，分别留标本进行TTC染色检测大鼠脑梗死体积，苏木精-伊红染色观察脑组织病理变化，TUNEL染色观察细胞凋亡，Western blot检测热休克蛋白22、AKT和磷酸化AKT蛋白表达变化，并根据以上结果得到相应结论。

3 课题设计中区别于国内外相关研究的特点：

（1）课题从组织学，细胞学及分子生物学角度详细叙述了丹参多酚酸盐干预在脑缺血再灌注动物模型中的神经保护作用。

（2）课题首次将丹参多酚酸神经保护作用与小分子热休克蛋白22的表达变化联系在一起。

4 文章学术水平与国内外同类研究的比较：

利用关键词ischemic、Salvianolic，cerebral与HSP22在pubmed未检索到文献，并用Salvianolate及HSP在pubmed仍未检索到文献，Salvianolate，ischemic和brain作为关键词在pubmed未检索到文献，Salvianolic、ischemic及brain为关键词在pubmed搜索到18篇文献，并且对丹参多酚酸的研究大多数集中在它的促细胞增殖及抗氧化作用方面，涉及到细胞凋亡的很少，故课题有很大的研究价值，明确丹参多酚酸盐的作用及其可能的神经保护机制对于进行临床用药指导有着积极的意义。

5专家意见与答疑：

专家意见1：丹酚酸B对脑缺血再灌注损伤的保护作用，已经有诸多报道，实验的创新性较弱。

作者答疑：丹酚酸B干预对脑缺血再灌注保护作用虽已有报道，但大部分都集中于其抗炎作用及改善能量代谢方面，实验是首次将丹酚酸B保护作用与热休克蛋白反应联系起来，并体现了丹酚酸B的抗凋亡作用。

专家意见2：表4中，AKT和磷酸化AKT的假手术组和模型组数据的标准差差异太大，说明手术技术不稳定。

作者答疑：在实验进行中，多次进行重复造模及结果分析得出以上数据，总体趋势一直未有明显变化，考虑到为手术操作不熟练手术技术不稳定所致，目前实验已全部完成，在以后的实验中会尽量避免上述问题的出现。

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