光生物调节治疗脊髓损伤的潜在靶点和作用机制

doi:10.4103/1673-5374.361534

摘要/Abstract

摘要：

光生物调节，又称为低强度激光疗法，是一种经典的无创物理疗法，广泛用于多种疾病的治疗，具有良好的抗炎和组织修复效果。作者既往研究发现以810 nm低强度激光治疗可减少巨噬细胞的M1极化，促进运动功能的恢复；然而，这种抑制作用的机制尚不清楚。近年来，由于转录组测序分析对阐明疾病进展方面发挥了重要的作用，因此实验对诱导小鼠骨髓巨噬细胞行M1极化，并以低强度激光进行干预。转录组测序结果揭示了光生物调节调控巨噬细胞极化的差异基因表达谱，进一步GO富集和KEGG富集分析这些差异表达的基因，并构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络和竞争性内源RNA网络。发现光生物调节可促进miR-330-5p的表达，从而抑制STAT3的表达；而miR-330-5p可与STAT3相互结合并抑制其表达；且诱导型一氧化氮合酶与STAT3表达变化趋势是一致。而后以光生物调节治疗脊髓挤压伤小鼠模型进行验证，证实光生物调节可减少诱导型一氧化氮合酶和STAT3的表达，并促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复。表明STAT3可能是光生物调节的潜在靶点，而miR-330-5p-STAT3通路是光生物调节发挥生物学功能的可能机制。

https://orcid.org/000-0003-0852-1196 (Xue-Yu Hu); https://orcid.org/0000-0002-7573-1583 (Zhe Wang)

关键词: RNA测序, 光生物调节, 脊髓损伤, 巨噬细胞, STAT3, miR-330-5p, 低强度激光治疗, 神经功能, 炎症信号通路, 竞争性内源性 RNA

Abstract: As a classic noninvasive physiotherapy, photobiomodulation, also known as low-level laser therapy, is widely used for the treatment of many diseases and has anti-inflammatory and tissue repair effects. Photobiomodulation has been shown to promote spinal cord injury repair. In our previous study, we found that 810 nm low-level laser therapy reduced the M1 polarization of macrophages and promoted motor function recovery. However, the mechanism underlying this inhibitory effect is not clear. In recent years, transcriptome sequencing analysis has played a critical role in elucidating the progression of diseases. Therefore, in this study, we performed M1 polarization on induced mouse bone marrow macrophages and applied low-level laser therapy. Our sequencing results showed the differential gene expression profile of photobiomodulation regulating macrophage polarization. We analyzed these genes using gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses. Networks of protein-protein interactions and competing RNA endogenous networks were constructed. We found that photobiomodulation inhibited STAT3 expression through increasing the expression of miR-330-5p, and that miR-330-5p binding to STAT3 inhibited STAT3 expression. Inducible nitric oxide synthase showed trends in changes similar to the changes in STAT3 expression. Finally, we treated a mouse model of spinal cord injury using photobiomodulation and confirmed that photobiomodulation reduced inducible nitric oxide synthase and STAT3 expression and promoted motor function recovery in spinal cord injury mice. These findings suggest that STAT3 may be a potential target of photobiomodulation, and the miR-330-5p/STAT3 pathway is a possible mechanism by which photobiomodulation has its biological effects.

Key words: competing endogenous RNA, inflammatory pathway, low-level laser therapy, macrophage, miR-330-5p, neurological function, photobiomodulation, RNA-seq, spinal cord injury, STAT3

. 光生物调节治疗脊髓损伤的潜在靶点和作用机制[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2023, 18(8): 1782-1788.

Cheng Ju, Yang-Guang Ma, Xiao-Shuang Zuo, Xuan-Kang Wang, Zhi-Wen Song, Zhi-Hao Zhang, Zhi-Jie Zhu, Xin Li, Zhuo-Wen Liang, Tan Ding, Zhe Wang, Xue-Yu Hu. Potential targets and mechanisms of photobiomodulation for spinal cord injury[J]. Neural Regeneration Research, 2023, 18(8): 1782-1788.

参考文献

引言

出版重点

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延伸阅读

NRR：空军军医大学西京医院胡学昱团队揭示光生物调节治疗脊髓损伤的潜在靶点和作用机制

撰文：巨承、马阳光、左晓霜、王哲、胡学昱

脊髓损伤作为一种神经系统疾病，可由外伤、车祸或高处坠落等外部因素引起，常导致运动、感觉和自主神经功能的丧失[1]。巨噬细胞是继发性脊髓损伤中最重要的免疫细胞，在损伤后被募集到损伤区域，其极化状态在损伤区域的局部微环境中至关重要[2-3]。巨噬细胞可以表现出M1（促炎）或M2（抗炎）极化状态，其M1型巨噬细胞可表达高水平的诱导型一氧化氮合酶和促炎细胞因子，从而加重炎症反应促进神经元凋亡，阻碍脊髓损伤修复[4]。因此，如何有效控制M1极化十分关键。光生物调节是一种被广泛使用的经典物理疗法，具有显着的抗炎和组织修复作用[5]。既往研究已证明光生物调节可减弱巨噬细胞的M1极化[6]。然而其潜在靶点和作用机制仍需进一步研究。#br# 近期，空军军医大学西京医院胡学昱团队在《中国神经再生研究（英文版）》（Neural Regeneration Research）上发表了题为“Potential targets and mechanisms of photobiomodulation for spinal cord injury”的研究，其揭示了光生物调节可调节巨噬细胞极化的差异基因表达谱，并进一步分析了差异基因的GO和KEGG富集，构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络以及内源性竞争性RNA网络，且发现了miR-330-5p-STAT3 途径可能是光生物调节抑制巨噬细胞M1极化的潜在机制。总之，这项研究为光生物调节治疗脊髓损伤提供了理论支撑。

脊髓损伤的病理过程复杂，可分为2个主要阶段：原发性损伤和继发性损伤[7]。由于原发性损伤是不可逆转的，因此继发性损伤成为人们关注的焦点。继发性损伤主要包括炎症反应、局部缺血和凋亡性坏死[8]。通过调节继发性炎症反应促进神经元修复是治疗脊髓损伤的重要策略之一。其中巨噬细胞是脊髓损伤炎症反应中最重要的细胞之一，可极化为促炎的M1巨噬细胞或抗炎的M2巨噬细胞，其极化状态在炎症微环境的调节中起决定性作用[9] ]。

因此，如何有效调控骨髓源巨噬细胞的极化方向和炎症反应对脊髓损伤的修复具有重要价值。转录组测序可以获得所含细胞或组织的所有转录序列信息，对发现和识别潜在的功能基因和信号通路有很大帮助，有助于揭示与疾病发生和发展密切相关的基因。近年来被广泛应用于基础研究、临床诊断、药物研究等领域[10]。胡学昱等在细胞水平上对光生物调节照射前后的巨噬细胞进行了转录组测序，包括长链非编码RNA、mRNA和环状RNA相关信息，其结果为筛选潜在靶基因提供了更多可能。

为更好地识别这些差异基因所涉及的生物学特征和信号通路，作者进行了 GO 和 KEGG 分析。 GO富集分析从生物学过程、细胞成分和分子功能三个方面进行。根据 GO 分析结果，研究发现其主要集中在免疫和代谢反应，这与巨噬细胞的生物学功能是一致的[11]。这些结果提供了可靠的信息以帮助进一步了解光生物调节对巨噬细胞的调节。在KEGG富集分析中，作者发现多个常见的信号通路发生了改变，如核因子κB信号通路、低氧诱导因子1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶-AKT信号通路和JAK-STAT信号通路。在以往的报道中，这些信号通路涉及神经损伤、氧化应激、成骨分化和炎症反应[12-13-14-15-16]。这些结果为进一步研究可能参与光生物调节的信号通路提供了方向。此外，研究对差异mRNA基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了有利价值。结果表明，在TOP50基因中，许多已被报道与炎症反应有关。如抑制STAT3可减少肾缺血再灌注损伤，而miR-221-3p可通过靶向JAK3/STAT3来抑制骨关节炎中的炎症反应[16-17]。SGK1通过上调核因子κB通路进而刺激多种炎症介质的表达，在肺纤维化、糖尿病肾纤维化和肝硬化中发挥重要作用[18]。Nfkb2可增加肠上皮细胞中由RelA驱动的促炎基因反应[19]。这些TOP基因所涉及的信号通路与KEGG分析比较一致。

因此，作者使用TOP 50基因分别与长链非编码RNA-miRNA以及环状RNA-miRNA构建了潜在的竞争性内源性RNA网络。长链非编码RNA可参与多种疾病的发生，可通过分子支架、RNA结合蛋白或竞争性内源性RNA发挥生物学功能[20]。环状RNA是通过选择性剪接产生的一种非编码共价闭合环状RNA，其3'和5'端可共价连接到没有自由末端的共价闭环结构。这些RNA在进化上是保守的，且可与微小RNA形成产生竞争性内源性RNA的相互作用[21]。微小RNA和mRNA之间的相互作用的可促进降解mRNA，并抑制其功能。这些分析有助于从非编码RNA角度阐明光生物调节参与巨噬细胞极化的潜在机制。

在以往的研究中，miR-330-5p可通过靶向CILP来抑制椎间盘退变[22]。上调miR-330-5p表达可抑制巨噬细胞的氧化应激和炎症[23]。靶向TIM3的miR-330-5p可抑制NLRP3激活诱导的心肌缺血再灌注损伤[24]。因此，作者进一步验证了miR-330-5p和STAT3之间的相互作用。结果显示，光生物调节可促进miR-330-5p的表达，从而抑制STAT3的表达；而miR-330-5p可与STAT3相互结合并抑制其表达；且诱导型一氧化氮合酶与STAT3表达变化趋势是一致。此外，体内研究表明光生物调节可减少诱导型一氧化氮合酶和STAT3的表达，并促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复。这些结果表明STAT3可能是光生物调节的潜在靶点，而miR-330-5p-STAT3通路是光生物调节发挥生物学功能的可能机制。这为光生物调节的临床应用提供了有力的理论支持。

图1 miR-330-5p-STAT3轴对骨髓源巨噬细胞M1极化的调节作用

图2光生物调节在脊髓损伤小鼠体内减少STAT3和诱导型一氧化氮合酶的表达并促进脊髓损伤的修复

总之，通过转录组测序和生物信息学分析，胡学昱等鉴定了光生物调节影响巨噬细胞极化中的 mRNA、长链非编码RNA和环状RNA差异表达谱，并对这些差异基因的GO和KEGG功能富集，蛋白质-蛋白质相互作用以及内源性竞争RNA网络进行分析。此外研究还表明光生物调节可通过miR-330-5p-STAT3通路调控M1巨噬细胞极化，并促进脊髓损伤小鼠后肢运动功能的恢复。这些研究为光生物调节治疗脊髓损伤提供了重要理论支撑。该研究仅在细胞水平进行生物信息学分析，其结果可能与组织水平存在差异。因此，后续需进一步进行脊髓组织水平的转录组测序，且组织水平与细胞水平的转录组测序联合分析可能更精确的识别差异基因。动物实验未对miR-330-5p-STAT3的机制进行探索，因此需要进一步的阐明光生物调节治疗的可能机制。

该研究由中国国家自然科学基金项目（81070996，81572151）以及陕西省重点研发项目（2020ZDLSF02-05，2021ZDLSF02-10）支持。

#br# #br# 原文链接：https://doi.org/10.4103/1673-5374.361534 #br# #br# 参考文献#br# [1] Alizadeh A, Dyck SM, Karimi-Abdolrezaee S. Traumatic spinal cord injury: an overview of pathophysiology, models and acute injury mechanisms. Front Neurol. 2019;10:282.#br# [2] Gensel JC, Zhang B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. 2015;1619:1-11.#br# [3] Kong X, Gao J. Macrophage polarization: a key event in the secondary phase of acute spinal cord injury. J Cell Mol Med. 2017;21(5):941-954.#br# [4] Donnelly DJ, Popovich PG. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 2008;209(2):378-388.#br# [5] Mussttaf RA, Jenkins DFL, Jha AN. Assessing the impact of low level laser therapy (LLLT) on biological systems: a review. Int J Radiat Biol. 2019;95(2):120-143.#br# [6] Ma Y, Li P, Ju C, et al. Photobiomodulation attenuates neurotoxic polarization of macrophages by inhibiting the Notch1-HIF-1α/NF-κB signalling pathway in mice with spinal cord injury. Front Immunol. 2022;13:816952.#br# [7] Ahuja CS, Wilson JR, Nori S, et al. Traumatic spinal cord injury. Nat Rev Dis Primers. 2017;3:17018.#br# [8] Anwar MA, Al Shehabi TS, Eid AH. Inflammogenesis of Secondary Spinal Cord Injury. Front Cell Neurosci. 2016;10:98.#br# [9] Fleming JC, Norenberg MD, Ramsay DA, et al. The cellular inflammatory response in human spinal cords after injury. Brain. 2006;129(Pt 12):3249-3269.#br# [10] Wu J, Fang Z, Liu T, et al. Maximizing the utility of transcriptomics data in inflammatory skin diseases. Front Immunol. 2021;12:761890.#br# [11] Greene CJ, Nguyen JA, Cheung SM, et al. Macrophages disseminate pathogen associated molecular patterns through the direct extracellular release of the soluble content of their phagolysosomes. Nat Commun. 2022;13(1):3072.#br# [12] Gao Y, Hu M, Niu X, et al. Dl-3-n-butylphthalide improves neuroinflammation in mice with repeated cerebral ischemia-reperfusion injury through the Nrf2-mediated antioxidant response and TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:8652741.#br# [13] Geng B, Wang X, Park KH, et al. UCHL1 protects against ischemic heart injury via activating HIF-1α signal pathway. Redox Biol. 2022;52:102295.#br# [14] Li H, Kong R, Wan B, et al. Initiation of PI3K/AKT pathway by IGF-1 decreases spinal cord injury-induced endothelial apoptosis and microvascular damage. Life Sci. 2020;263:118572.#br# [15] Qiu Y, Yang J, Ma L, et al. Limonin isolated from pomelo seed antagonizes Aβ25-35-mediated neuron injury via PI3K/AKT signaling pathway by regulating cell apoptosis. Front Nutr. 2022;9:879028.#br# [16] Quero L, Tiaden AN, Hanser E, et al. miR-221-3p Drives the Shift of M2-Macrophages to a Pro-Inflammatory Function by Suppressing JAK3/STAT3 Activation. Front Immunol. 2019;10:3087.#br# [17] Wang J, Xiong M, Fan Y, et al. Mecp2 protects kidney from ischemia-reperfusion injury through transcriptional repressing IL-6/STAT3 signaling. Theranostics. 2022;12(8):3896-3910.#br# [18] Lu RQ, Zhang YY, Zhao HQ, et al. SGK1, a critical regulator of immune modulation and fibrosis and a potential therapeutic target in chronic graft-versus-host disease. Front Immunol. 2022;13:822303.#br# [19] Chawla M, Mukherjee T, Deka A, et al. An epithelial Nfkb2 pathway exacerbates intestinal inflammation by supplementing latent RelA dimers to the canonical NF-κB module. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(25):e2024828118.#br# [20] Ju C, Liu R, Zhang YW, et al. Mesenchymal stem cell-associated lncRNA in osteogenic differentiation. Biomed Pharmacother. 2019;115:108912.#br# [21] Chen LL. The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(8):475-490.#br# [22] Li S, Liu J, Chen L. MiR-330-5p inhibits intervertebral disk degeneration via targeting CILP. J Orthop Surg Res. 2021;16(1):440.#br# [23] Liu J, Huang GQ, Ke ZP. Silence of long intergenic noncoding RNA HOTAIR ameliorates oxidative stress and inflammation response in ox-LDL-treated human macrophages by upregulating miR-330-5p. J Cell Physiol. 2019;234(4):5134-5142.#br# [24] Zuo W, Tian R, Chen Q, et al. miR-330-5p inhibits NLRP3 inflammasome-mediated myocardial ischaemia-reperfusion injury by targeting TIM3. Cardiovasc Drugs Ther. 2021;35(4):691-705.#br#

#br# 胡学昱，医学博士，西京医院骨科临床研究中心执行主任，博士生导师。长期从事脊髓、周围神经损伤修复以及脊柱疾病相关临床研究，主持国家自然科学基金2项、发表学术论文70篇，其中SCI论文45篇，通讯作者25篇，最高IF达8.322。主译专著2部，参编参译专著6部，获得国家发明专利9项，实用新型专利24项。还获得国家科技进步二等奖，陕西省科学技术一等奖，国家教育部科技奖进步一等奖等10余项奖励。