MicroRNA-219通过靶向CaMKⅡγ调节培养的海马神经元中谷氨酸诱导的神经毒性

doi:10.4103/1673-5374.235059

摘要/Abstract

摘要：

脓毒症脑病是脓毒症常见并发症之一，但关于微小RNA(microRNA, miRNA)在脓毒症脑病中的研究还是很少。实验通过在大鼠海马神经元中转染miR-219模拟物(mimic)来过表达miR-219，观察miR-219对125 μM谷氨酸诱导的大鼠海马神经元毒性的保护作用，并阐述其作用机制。利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测谷氨酸诱导海马神经元中miR-219和CaMKⅡγ mRNA的表达。海马神经元中转染miR-219模拟物(mimic)后，MTT和流式细胞仪分析法检测miR-219对谷氨酸诱导的海马神经元细胞活力和细胞凋亡的影响。利用荧光素酶报告基因系统检测CaMKⅡγ是miR-219作用靶基因。利用Western blot和挽救实验来检测CaMKⅡγ的表达，并进一步验证miR-219在海马神经元中是通过调控CaMKⅡγ来发挥作用。MTT和qRT-PCR结果显示，海马神经元细胞活力和miR-219表达在谷氨酸刺激的海马神经元中显著下降，但是CaMKⅡγ mRNA的表达却显著上升。MTT，流式细胞仪分析法和caspase-3活性分析结果显示，过表达miR-219能够提高谷氨酸诱导所引起的细胞活力，降低细胞凋亡率和caspase-3活性。荧光素酶报告基因系统检测结果显示，miR-219 mimic转染组中荧光素酶的活性显著降低。挽救实验结果说明，过表达CaMKⅡγ可以逆转miR-219的生物学效应。上述结果数据说明，谷氨酸诱导的大鼠海马神经元中miR-219表达下调，CaMKⅡγ是miR-219作用靶基因，miR-219能够通过负调控CaMKⅡγ来减轻谷氨酸诱导的神经元兴奋性毒性作用。

orcid:0000-0002-1496-9141(Feng Xu)

关键词: 神经再生, 脑损伤, 脓毒症脑病, miR-219, 海马神经元, 谷氨酸, 兴奋性毒性, 凋亡, Caspase-3, CaMKⅡ&gamma, 荧光报告酶基因系统, 神经保护

Abstract:

Septic encephalopathy is a frequent complication of sepsis, but there are few studies examining the role of microRNAs (miRs) in its pathogenesis.In this study, a miR-219 mimic was transfected into rat hippocampal neurons to model miR-219 overexpression. A protective effect of miR-219 was observed for glutamate-induced neurotoxicity of rat hippocampal neurons, and an underlying mechanism involving calmodulin-dependent protein kinase II γ (CaMKIIγ) was demonstrated. miR-219 and CaMKIIγ mRNA expression induced by glutamate in hippocampal neurons was determined by quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR). After neurons were transfected with miR-219 mimic, effects on cell viability and apoptosis were measured by 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and flow cytometry. In addition, a luciferase reporter gene system was used to confirm CaMKIIγ as a target gene of miR-219. Western blot assay and rescue experiments were also utilized to detect CaMKIIγ expression and further verify that miR-219 in hippocampal neurons exerted its effect through regulation of CaMKIIγ. MTT assay and qRT-PCR results revealed obvious decreases in cell viability and miR-219 expression after glutamate stimulation, while CaMKIIγ mRNA expression was increased. MTT,flow cytometry, and caspase-3 activity assays showed that miR-219 overexpression could elevate glutamate-induced cell viability, and reduce cell apoptosis and caspase-3 activity. Moreover, luciferase CaMKIIγ-reporter activity was remarkably decreased by co-transfection with miR-219 mimic, and the results of a rescue experiment showed that CaMKIIγ overexpression could reverse the biological effects of miR-219. Collectively, these findings verify that miR-219 expression was decreased in glutamate-induced neurons, CaMKIIγ was a target gene of miR-219, and miR-219 alleviated glutamate-induced neuronal excitotoxicity by negatively controlling CaMKIIγ expression.

Key words: nerve regeneration, brain injury, septic encephalopathy, miR-219, hippocampal neurons, glutamate, excitotoxicity, apoptosis;caspase-3, calmodulin-dependent protein kinase II γ, luciferase reporter gene system, neuroprotection, neural regeneration

. MicroRNA-219通过靶向CaMKⅡγ调节培养的海马神经元中谷氨酸诱导的神经毒性[J]. 中国神经再生研究(英文版), 2018, 13(7): 1216-1224.

Ting Wang, Qun Cai, Wen-Jie Yang, Hai-Hua Fan, Jian-Feng Yi, Feng Xu. MicroRNA-219 alleviates glutamate-induced neurotoxicity in cultured hippocampal neurons by targeting calmodulin-dependent protein kinase II gamma[J]. Neural Regeneration Research, 2018, 13(7): 1216-1224.

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延伸阅读

Neural Regen Res: miR-219可抑制谷氨酸诱导的神经元兴奋性毒性？

中国苏州大学王霆等发表在《中国神经再生研究（英文版）》杂志2018年7月第7期的一项研究发现，谷氨酸诱导的大鼠海马神经元中miR-219表达下调，CaMKⅡγ是miR-219作用靶基因，miR-219能够通过负调控CaMKⅡγ来减轻谷氨酸诱导的神经元兴奋性毒性作用。

脓毒症脑病是脓毒症常见并发症之一，谷氨酸诱导的神经元兴奋性毒性作用是脓毒症脑病形成和发展的病因之一。miR-219主要在脑组织中表达，参与阿尔茨海默病和精神分裂症的发生发展。然而，关于其在脓毒症脑病中的作用研究还很少。

王霆等通过在大鼠海马神经元中转染miR-219模拟物(mimic)来过表达miR-219，观察miR-219对125 μM谷氨酸诱导的大鼠海马神经元的保护作用，并阐述其作用机制。MTT和qRT-PCR结果显示，海马神经元细胞活力和miR-219表达在谷氨酸刺激的海马神经元中显著下降，但是CaMKⅡγ mRNA的表达却显著上升。MTT，流式细胞仪分析法和caspase-3活性分析结果显示，过表达miR-219能够减轻谷氨酸诱导所引起的细胞活力的降低，细胞凋亡率和caspase-3活性。荧光素酶报告基因系统检测结果显示，miR-219 mimic转染组中荧光素酶的活性显著降低。挽救实验结果说明，过表达CaMKⅡγ可以逆转miR-219的生物学效应。研究结果证实了，miR-219对谷氨酸诱导海马神经元兴奋性毒性的保护作用。

Article: "MicroRNA-219 alleviates glutamate-induced neurotoxicity in cultured hippocampal neurons by targeting calmodulin-dependent protein kinase II gamma," by Ting Wang1, 2, Qun Cai3, Wen-Jie Yang4, Hai-Hua Fan4, Jian-Feng Yi4, Feng Xu1(1 Department of Emergency, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou, Jiangsu Province, China; 2 Department of Emergency, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong, Jiangsu Province, China; 3 Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong, Jiangsu Province, China; 4 Medical College of Nantong University, Nantong, Jiangsu Province, China).

Wang T, Cai Q, Yang WJ, Fan HH, Yi JF, Xu F (2018) MicroRNA-219 alleviates glutamate-induced neurotoxicity in cultured hippocampal neurons by targeting calmodulin-dependent protein kinase II gamma. Neural Regen Res 13(7):1216-1224.

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