NRR：暨南大学陈功教授团队通过双光子活体成像证明星形胶质细胞可原位转分化为功能性神经元
撰文：项宗勤，和澍，雷文亮，陈功
中枢神经系统的损伤造成神经元的进行性死亡，可引起神经功能障碍。由于神经元的不可再生特性，导致神经系统的损伤不可逆，目前临床上还没有有效的治疗方法。全球每年投入大量经费来研发治疗神经系统疾病的药物，仍未取得突破性进展。随着人口老龄化，这些神经系统疾病对社会的影响会越来越突出，比如阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病患者伴随着智力衰退、行动能力减弱，这给照顾这类患者带来了巨大的经济压力和社会压力。
近年来通过胶质细胞原位转分化为神经元来进行大脑修复的技术在啮齿类动物模型中进行了大量的研究，目前已有很多工作发表在国际权威期刊上，为神经系统退行性疾病和损伤的康复提供了全新的治疗策略和途径。但是，最近有研究认为，星形胶质细胞并没有转分化成神经元的能力，且病毒系统介导的转分化存在大量的泄漏表达，即标签蛋白阳性的神经元并非来源于星形胶质细胞[1]。
来自中国暨南大学陈功教授团队近年来利用神经转录因子NeuroD1成功诱导星形胶质细胞原位转分化为功能性神经元，并实现了疾病模型的修复[2-7]。为了有力回答目前在转分化领域的争议，必须设计更加有说服力的证据来证实星形胶质细胞能够原位转分化成功能性神经元。
陈功教授等在《中国神经再生研究（英文版）》（Neural Regeneration Research）上发表了题为“Two-photon live imaging of direct glia-to-neuron conversion in the mouse cortex”的研究。该研究采用长时程双光子成像技术连续捕捉小鼠皮质中分裂的胶质细胞和谱系示踪的星形胶质细胞向神经元的原位转分化过程。进一步证明了小鼠皮质的胶质细胞能够在单个神经转录因子NeuroD1的作用下转化成功能性神经元。同时发现，转化而来的神经元有长神经突和动态的生长锥，并可径向或切向迁移到合适的位置，进而证明了胶质细胞在转分化过程中具有迁移特性。此外，双光子钙成像和膜片钳记录证实新生成的神经元表现出同步钙信号、重复动作电位和自发突触反应，表明它们在局部神经回路中建立了功能性突触连接。这项研究提供了星形胶质细胞直接向神经转化的最直观证据，并明确表明，成年哺乳动物的大脑在神经再生和神经回路重建方面具有高度的可塑性。
由于逆转录病毒只在分裂细胞(如增殖的神经胶质细胞)中表达，而在非分裂细胞(如神经元)中不表达，作者采用逆转录病毒载体携带目的基因NeuroD1在小鼠皮质中实现了在神经胶质细胞中的特异性表达(图1A)。由于在CAG启动子下NeuroD1的高表达，作者观察到胶质细胞从第7天到第9天的2d时间内发生的快速转分化过程。对照病毒CAG::GFP感染的分裂的胶质细胞在整个成像期间都保持正常的胶质细胞形态(图1B)。相比之下，多种逆转录病毒载体CAG::NeuroD1-GFP感染的胶质细胞在注射后前3-9d内表现出快速的形态变化(图1C和D)。将脑样本固定并进行免疫染色，证实其中大量神经元样细胞确实是NeuN阳性的神经元(图1E和F)。此外，统计双光子观察的GFP阳性细胞得出，在5-7d时约40%的表达NeuroD1-GFP的细胞显示出长突起的神经元形态，在7-9d时，超过70%的GFP阳性细胞表现出神经元形态，而只有一小部分保持胶质形态(图1G)。在5-7d时，约30%的表达NeuroD1-GFP的胶质细胞转化为NeuN阳性神经元，在7-9d时约60%转化NeuN阳性的神经元(图1H)。这些结果表明，逆转录病毒CAG::NeuroD1-P2A-GFP感染的分裂中的胶质细胞中至少有60%最终直接转化为NeuN阳性的神经元。因此，该研究通过双光子实时观察到增殖的胶质细胞可以直接转化为神经元。
图1 双光子在体成像追踪分裂的胶质细胞原位转分化成神经元（图源：Xiang et al., Neural Regen Res, 2024）
在健康的大脑中，星形胶质细胞不具分裂特性，因此逆转录病毒感染的星形胶质细胞很少且不足以实现组织修复。因此，为追踪小鼠皮质中静息态的星形胶质细胞原位向神经元的转化过程，陈功教授等利用Aldh1l1-CreERT2与Ai14小鼠杂交建立的星形胶质细胞谱系追踪小鼠，利用腺相关病毒在谱系示踪的星形胶质细胞过表达NeuroD1，双光子连续成像观察到被对照病毒感染的星形胶质细胞在4周的成像中没有显示出太多的形态和位置变化(图2A)。在NeuroD1组tdTomato阳性的星形胶质细胞在7-25d逐渐转变为具有明显长神经突的神经元形态(图2B)。大多数过表达NeuroD1的tdTomato阳性的星形胶质细胞最初表现为典型的星状形态(图2B，注射后7d)，部分星形胶质细胞在感染后约2周内迅速失去精细突起，开始延伸长神经突(图2B， 注射后13-25d)，向神经元形态转化。综上所述，这些结果表明，成年小鼠皮质的谱系示踪的星形胶质细胞在NeuroD1过表达4周后可以直接转分化为神经元，并且连续双光子实时成像显示出清晰的转分化过程。
图2 双光子在体成像追踪谱系示踪的星形胶质细胞原位转分化成神经元（图源：Xiang et al., Neural Regen Res, 2024）
逆转录病毒感染分裂的胶质细胞后，逐渐延伸一条突起，在延长的突起远端观察到生长锥杨结构，并且这些生长锥具有高度动态的伸展和收缩活动(图3A)。这些结果表明，成年小鼠皮质新转化的神经元积极探索其局部环境，寻找合适的投射靶点。同时作者发现胶质细胞在转分化过程中，细胞有明显的细胞迁移现象，同时迁移方向沿着凸起生长的方向。虽然成年小鼠脑内的内源性星形胶质细胞由于彼此之间形成间隙连接而很少迁移，但在的延时成像分析中，一些逆转录病毒感染的细胞显示出明显的迁移运动，进一步证明了这些细胞正在经历转分化的过程(图3B)。
#br#
图3 逆转录病毒介导的胶质细胞转分化过程中存在明显的生长锥样结构和细胞迁移现象（图源：Xiang et al., Neural Regen Res, 2024）
总之，陈功教授等首次报道了通过双光子活体成像观察了体内星形胶质细胞转分化为神经元的实时过程，并且报道了转分化过程中的细胞有突起的伸长和末端动态的生长锥，以及细胞切向迁移现象。这些结果也说明了胶质细胞在转分化过程中积极寻找靶向投射。通过双光子Ca2+成像和膜片钳记录证实，新生成的神经元表现出同步钙信号、重复动作电位和自发突触反应，表明它们在局部神经回路中建立了功能性突触连接。为转分化领域提供了有力的证据。
当然该研究也存在一定局限性。首先其研究对象是健康的没有损伤的小鼠皮质，星形胶质细胞处于静息状态。同时在谱系示踪的小鼠中，转分化现象有所降低，被tdTomato标记的星形胶质细胞并不能实现转分化。在逆转录病毒系统中，病毒感染的分裂中的胶质细胞非常有限，但是这些被病毒感染的胶质细胞大部分都实现了转分化过程，这很大程度说明了胶质细胞转分化成神经元的可行性。在神经退行性疾病中，损伤区域大量的神经元丢失和胶质瘢痕的产生是否影响了转分化的效率和新生神经元的存活，目前还需要进一步研究。总之，此次研究通过双光子在体成像进一步说明星形胶质细胞转分化成神经元的可行性。
原文链接：https://doi.org/10.4103/1673-5374.386401
参考文献
[1] Wang LL, Serrano C, Zhong X, et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 2021;184:5465-5481.e16(21).
[2] Guo Z, Zhang L, Wu Z, et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 2014;14(2):188-202.
[3] Wu Z, Parry M, Hou XY, et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into GABAergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 2020;11(1):1105.
[4] Ge LJ, Yang FH, Li W, et al. In vivo neuroregeneration to treat ischemic stroke through NeuroD1 AAV-based gene therapy in adult non-human primates. Front Cell Dev Biol. 2020;8:590008.
[5] Chen YC, Ma NX, Pei ZF, et al. A NeuroD1 AAV-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 2020;28(1):217-234.
[6] Zhang L, Lei Z, Guo Z, et al. Development of neuroregenerative gene therapy to reverse glial scar tissue back to neuron-enriched tissue. Front Cell Neurosci. 2020;14:594170.
[7] Xiang Z, Xu L, Liu M, et al. Lineage tracing of direct astrocyte-to-neuron conversion in the mouse cortex. Neural Regen Res. 2021;16(4):750-756.
暨南大学项宗勤、和澍和陈蓉杰为并列第一作者，李雯副研究员、王向宇教授、陈功教授和雷文亮研究员为通讯作者。
