免疫炎症反应是脊髓损伤病理过程中的中心事件,可显著影响神经再生和功能恢复,但对外周性免疫炎症反应的了解仍较少。实验首先通过高通量测序获得了脊髓损伤患者外周血中的微小RNA表达谱,同时利用GEO数据库GSE151371获取了脊髓损伤患者的mRNA表达谱。然后利用生物信息学方法鉴定出54种差异表达的微小RNA和1656种差异表达的基因。进而通过功能富集分析发现,多种常见的免疫炎症相关信号通路可在脊髓损伤后发生了异常激活,如中性粒细胞外陷阱形成通路、T细胞受体信号通路、核因子κB信号通路。而后结合加权基因共表达网络分析和LASSO逻辑回归和SVM-RFE算法的机器学习算法筛选出3种与脊髓损伤显著相关的生物标志物ANO10,BST1和ZFP36L2。随后,通过受试者人工曲线分析在原始训练数据集和临床样本中验证了这3种基因的表达水平和诊断性能。定量聚合酶链式反应结果显示,脊髓损伤患者外周血中ANO10和BST1表达升高,而ZFP36L2表达下降。同时,利用Cytoscape构建了微小RNA-mRNA相互作用网络。此外,CIBERSORT工具用于评估SCI患者中外周血中22种免疫细胞的比例,可见与健康受试者相比,脊髓损伤患者的幼稚B细胞、浆细胞、单核细胞和中性粒细胞比例增加,而记忆B细胞、CD8+T细胞、静息自然杀伤细胞、静息树突状细胞和嗜酸性粒细胞比例明显降低,且ANO10, BST1和ZFP26L2表达水平与免疫细胞比例密切相关。该研究结果为脊髓损伤免疫炎症相关治疗策略的制定提供新的方向,并提出ANO10,BST1和ZFP36L2是脊髓损伤的潜在生物标志物。
https://orcid.org/0000-0002-8095-591X (Jianwen Xu); https://orcid.org/0000-0002-0528-5354 (Jianmin Chen)
对于慢性脊髓损伤患者来说,传统的治疗方法主要是康复干预。除此之外,其他治疗主要侧重于脊髓损伤并发症,如尿路感染、压疮、骨质疏松症、血栓形成等。但目前还没有治疗脊髓损伤的有效药物,外科医生也很少对慢性脊髓损伤患者进行手术治疗。因此,迫切需要进一步开发针对慢性脊髓损伤患者的有效疗法。此次随机对照研究纳入慢性胸段脊髓损伤患者30例,比较负重行走训练强化康复治疗与强化康复治疗结合手术干预治疗的效果。该研究于 2016 年 2 月 3 日在 ClinicalTrials.gov 注册(NCT02663310)。结果发现,与只接受负重行走训练的患者相比,接受手术干预结合负重行走训练的患者更脊髓损伤严重程度和痉挛症状减轻,肠道和膀胱功能恢复更快,且具备安全性。因此主张针对慢性 SCI 治疗可考虑手术结合负重行走训练强化康复治疗干预。
https://orcid.org/0000-0003-4039-4246 (Kwok-Fai So); https://orcid.org/0000-0002-7229-0081 (Xiao-Ming Xu)
炎症微环境和神经兴奋性毒性会阻碍脊髓损伤后的神经元再生和功能恢复。鲁索替尼(Ruxolitinib)是一种JAK-STAT抑制剂,可治疗自身免疫性疾病和关节炎,并可对抗炎症因子风暴。尽管研究已显示了鲁索替尼在神经系统创伤中具有显著的神经保护潜力,但其增强脊髓损伤后功能恢复的确切机制,特别是对星形胶质细胞的影响,仍然不明。此次实验首先在T10脊髓挫伤小鼠模型中发现,灌胃鲁索替尼可有效改善其后肢运动功能,并缩小脊髓损伤面积。进一步转录组测序分析结果显示,鲁索替尼可减轻脊髓损伤后的炎症和免疫反应,恢复了EAAT2表达,降低谷氨酸水平,减轻兴奋性毒性。随后发现鲁索替尼可抑制损伤脊髓中JAK2和STAT3的磷酸化,并通过抑制核因子κB信号通路,降低核因子κB磷酸化水平和炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达。最后在谷氨酸诱导兴奋性毒性星形胶质细胞中发现,鲁索替尼通过抑制STAT3的激活来恢复星形胶质细胞中EAAT2的表达并增强谷氨酸的摄取,从而减少谷氨酸诱导的神经兴奋性毒性、钙内流、氧化应激和细胞凋亡,并增加树突分支的复杂性。上述结果表明,鲁索替尼可通过挽救星形胶质细胞EAAT2的表达来恢复谷氨酸稳态减少神经兴奋性毒性,并有效减轻脊髓损伤后的炎症反应和免疫反应,从而促进脊髓损伤的功能恢复。
https://orcid.org/0000-0001-5567-0536 (Xiaojian Cao); https://orcid.org/0000-0003-3156-4856 (Jie Chang);
https://orcid.org/0000-0003-0753-9503 (Tao Sui)
有研究表明,骨髓间充质干细胞来源的小细胞外囊泡可通过携带微小核糖核酸(microRNA)诱导巨噬细胞表型的变化,从而减轻炎症。作者课题组在以往研究中,总结了干细胞来源的小细胞外囊泡携带 miRNAs 可调节巨噬细胞极化从而降低组织炎症。因此,实验探讨了低氧预处理的骨髓间充质干细胞来源小细胞外囊泡在大鼠脊髓损伤后巨噬细胞免疫调节中的作用及其在脊髓修复中的意义。通过密度梯度超速离心从骨髓间充质干细胞上清液中分离出小细胞外囊泡或骨髓间充质干细胞来源的小细胞外囊泡。体内实验验证了常氧预处理骨髓间充质干细胞来源的小细胞外囊泡和低氧预处理的骨髓间充质干细胞来源小细胞外囊泡均能减轻脊髓损伤,促进脊髓损伤大鼠的运功功能,这种现象与脊髓中巨噬细胞向 M2 型极化相关;进一步的体外实验结果显示,相较于小细胞外囊泡,低氧预处理的骨髓间充质干细胞来源小细胞外囊泡更有益于促进M2型巨噬细胞极化,减轻脊髓炎症。为了探寻这种疗效差异的原因,实验进一步完成了小细胞外囊泡和低氧预处理的骨髓间充质干细胞来源小细胞外囊泡中的 miRNA高通量测序,结合差异分析结果并查阅miRNA相关数据库(miRBase),确定了 miR-146a-5p 作为骨髓间充质干细胞来源的小细胞外囊泡疗效的关键因子之一。最后的过表达或者抑制miRNA的体外研究表明,miR-146a-5p可以促进M2型巨噬细胞极化,并与下调IRAK1/TRAF6/NF-κB通路相关。该研究成果为低氧预处理的骨髓间充质干细胞来源小细胞外囊泡作为脊髓损伤治疗工具的应用提供了新的见解。
https://orcid.org/0000-0002-4483-7465 (Chunmei Chen); https://orcid.org/0000-0002-4490-0380 (Chunhua Wang)
既往研究发现血红素加氧酶1可在多种中枢神经系统损伤模型中上调,且其具有抗炎作用,并在调节细胞氧化还原稳态方面至关重要。二甲双胍是一种治疗2型糖尿病的经典药物,具有抑制铁死亡的作用。既往有研究表明,二甲双胍在治疗心血管和消化系统疾病中能上调血红素加氧酶1的表达。因此实验假设血红素加氧酶1可在二甲双胍治疗脊髓损伤后神经细胞铁死亡中发挥了重要的作用。为证实这一假设,实验首先基于GEO数据库使用生物信息学方法分析得出,脊髓损伤大鼠脊髓中血红素加氧酶1表达上调。然后在T9脊髓压迫损伤大鼠模型中也证实这一现象,同时发现脊髓神经细胞中存在铁死亡现象。而连续14d腹腔注射二甲双胍可上调脊髓损伤大鼠血红素加氧酶1的表达,并减少神经细胞铁死亡。而后实验使用慢病毒脊髓局部敲低血红素加氧酶1的表达,可见二甲双胍对脊髓损伤后铁死亡的作用明显减弱。这一研究提示,二甲双胍具有抑制脊髓损伤后神经细胞铁死亡的作用,该作用部分依赖于上调的血红素加氧酶1实现的。
https://orcid.org/0000-0001-8435-4225 (Meihua Li)
既往研究显示,具有雌激素样作用的黄酮类化合物,鹰嘴豆芽素A可作为脑缺血再灌注损伤的神经保护剂,但是其对脊髓损伤的作用尚不清楚。实验以重物打击法构建了脊髓损伤大鼠模型,然后连续14d腹腔注射鹰嘴豆芽素A(40mg/kg)进行治疗。结果显示,鹰嘴豆芽素A能有效减轻损伤脊髓神经元和组织损伤,抑制脊髓神经元炎症反应和氧化应激,减少细胞凋亡和焦亡。进一步研究发现,鹰嘴豆芽素A能够抑制损伤脊髓中NLRP3炎症小体ASC,NLRP3和GSDMD的表达以及Toll样受体4/核因子κB通路,激活Nrf2/血红素加氧酶1信号通路以及自噬标志物LC3 II,Beclin-1和P62的表达。且鹰嘴豆芽素A的效果与甲基强的松龙的效果接近。因此提示,鹰嘴豆芽素A通过影响Toll样受体4/核因子κB和Nrf2/血红素加氧酶1信号通路参与其保护脊髓损伤神经细胞的作用,该研究提示,鹰嘴豆芽素A具有治疗改善脊髓损伤的效果。
https://orcid.org/0000-0003-3173-6929 (Xianfeng Lou); https://orcid.org/0009-0007-0866-8127 (Wenming Pan)
脊髓损伤诱导的运动功能障碍与神经炎症有关。有研究发现,羽扇烯酮是一种广泛存在于多种植物的三萜类化合物,且在慢性炎症环境中存在显著的抗炎活性,但其是否也能对在脊髓损伤诱导的急性炎症产生作用尚未见报道。实验以重物打击法构建了小鼠脊髓损伤模型,而后腹腔注射羽扇烯酮(8 mg/kg,2次/d);并以脂多糖和ATP干预BV2细胞模拟脊髓损伤后的炎症反应。结果显示,羽扇烯酮可减轻IκBα和p65核转位,还可通过调节核因子κB抑制NLRP3炎症小体的产生,也能增强促炎性M1小胶质细胞向抗炎性M2小胶质细胞的转化。此外,羽扇烯酮可通过抑制核因子κB通路改善NLRP3炎症小体的过度激活和NLRP3诱导的小胶质细胞极化和焦亡。由此提出羽扇烯酮可通过抑制炎症小体对脊髓损伤发挥治疗作用。
https://orcid.org/0000-0002-3407-0715 (Fudong Li); https://orcid.org/0000-0002-3788-305X (Qingjie Kong)
骨骼肌的协调收缩依赖于自身与多种脊髓运动神经元之间的选择性连接。然而,目前对支配不同肌肉的脊髓运动神经元的空间分布研究是极为有限的。此次实验结合与溶剂清除器官三维成像兼容(3DISCO)的多重逆行示踪方法,并利用光片荧光显微镜三维成像技术研究了股神经、闭孔神经、臀下神经、腓深神经以及胫神经支配的小鼠后肢深层肌肉不同运动神经元的空间分布和相对位置。此外,实验还提出了“信使区”假说,即在支配协同或拮抗剂肌群的运动神经元池之间存在交错区域(被定义为信使区),其中交错分布的神经元可能作为信使神经元参与肌肉协调。这项研究不仅揭示了支配小鼠不同深层肌肉的多个运动神经元池之间精确的相互位置关系,还更新和补充了支配小鼠肌肉的脊髓运动神经元的系统化三维视觉图谱,而且对于理解协调肌肉活动的潜在机制和运动回路的结构也具有积极意义。
https://orcid.org/0000-0001-9932-642X (Xiaofeng Yin)
有研究表明,成纤维细胞生长因子21可以通过促进血红素加氧酶1的泛素化和降解来抑制肝细胞的铁死亡,但成纤维细胞生长因子21在脊髓损伤后铁死亡中的作用尚不清楚。实验假设成纤维细胞生长因子21对脊髓损伤后铁死亡有抑制作用,结果显示,脊髓损伤大鼠脊髓组织中的成纤维细胞生长因子21水平下降,铁死亡明显加重,但血红素加氧酶1的表达迅速增加。血红素加氧酶1加重了脊髓损伤后的铁死亡,而成纤维细胞生长因子21通过下调血红素加氧酶1抑制了铁死亡过程。因此认为,激活成纤维细胞生长因子21可能为脊髓损伤提供一种潜在的治疗方法。
https://orcid.org/0000-0002-0050-4327 (Xiaolong Lin)
脊髓损伤(SCI)后,免疫细胞广泛浸润,加剧了损伤并导致神经进一步退化。因此,当前研究的一个主要目标是针对免疫反应治疗脊髓损伤。虽然已有很多研究分析了脊髓损伤后复杂的炎症过程,但以往文献中关于局部细胞因子调控的时间线仍存在很大差异。为了解脊髓损伤后2周细胞因子调节时间线,确定细胞因子水平的性别差异以及随脊髓损伤严重程度显著变化的局部细胞因子。实验建立轻度、中度、重度挫伤或完全横断大鼠模型,在伤后不同时间点采集以损伤处为中心的 7 mm脊髓,用细胞因子/凝血因子 27-Plex 分析法对组织匀浆进行分析。结果显示,包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β和白细胞介素6在内的促炎细胞因子在损伤后均上调,但在损伤后约24h内恢复到未损伤时的水平,而包括单核细胞趋化蛋白1在内的趋化因子在损伤后数天内仍上调。相反,包括白细胞介素10 和血管内皮生长因子在内的几种抗炎细胞因子和生长因子在伤后7天内下调。损伤后,专门影响参与神经胶质疤痕形成的星形胶质细胞的组织金属蛋白酶抑制剂1的增加幅度超过了所有其他细胞因子,比未损伤的大鼠高 26.9 倍。在轻度挫伤后,有 11 种细胞因子表现出性别差异性;但在重度挫伤后,只有瘦素水平在雌性和雄性大鼠之间存在差异。总之,促炎细胞因子启动了炎症过程,并在受伤后数小时内恢复到基线水平,趋化因子在受伤后数天内继续招募免疫细胞,而抗炎细胞因子在受伤后1周内下调,轻度伤后细胞因子的性别差异随着受伤程度的加重而减弱。这项研究的结果确定了影响免疫细胞浸润的关键趋化因子和参与损伤后神经胶质瘢痕形成的重要细胞因子,这对研究人员开发针对损伤后二次损伤的治疗方法至关重要。
https://orcid.org/0000-0002-5062-5952 (Amgad S. Hanna)
神经炎症会加剧脊髓损伤后的继发性损伤,而小胶质细胞/巨噬细胞焦亡对神经炎症十分重要。环状RNA也被证明可参与中枢神经系统疾病。但是环状RNA在脊髓损伤后调节小胶质细胞/巨噬细胞焦亡的功能作用和机制仍缺乏深入的研究。实验发现,在脊髓损伤雌性大鼠模型中,小胶质细胞/巨噬细胞发生焦亡,而脊髓中circ0000381水平上调。进一步的研究表明,circ0000381可作为内源性海绵,与miR-423-3p结合,并抑制后者的活性,并促进增加焦亡标志物NLRP3的表达。因此,circ0000381上调可能是限制脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞焦亡的代偿性变化。且敲低circ0000381能显著增强miR-423-3p对小胶质细胞/巨噬细胞焦亡的诱导。这项研究提示脊髓损伤后上调的circ0000381是减轻小胶质细胞/巨噬细胞焦亡的保护机制。因此,circ0000381可作为脊髓损伤治疗的新靶点。
https://orcid.org/0009-0001-8681-9660 (Xueming Chen)
人牙髓干细胞移植已被证实是一种治疗脊髓损伤的有效策略。由于旁分泌机制可能是干细胞移植治疗的基础,且含有牙髓干细胞分泌组的条件培养基能促进脊髓损伤的恢复,但其作用机制尚不清楚。实验首先以重物打击法构建了脊髓损伤大鼠模型,经腹腔注射牙髓干细胞条件培养基,结果发现牙髓干细胞条件培养基可有效促进脊髓损伤大鼠感觉和运动功能的恢复,且降低损伤脊髓中小胶质细胞中焦亡标记物NLRP3、GSDMD、Caspase-1和白细胞介素1β的表达,促进轴突和髓鞘再生,并抑制神经胶质瘢痕的形成。此外,在脂多糖诱导的BV2细胞模型中,牙髓干细胞条件培养基可通过抑制NLRP3/Caspase-1/白细胞介素1β通路保护细胞免受焦亡。上述结果表明,牙髓干细胞条件培养基可通过抑制NLRP3/Caspase-1/白细胞介素1β通路来减轻小胶质细胞焦亡,从而促进脊髓损伤后神经功能的恢复。因此牙髓干细胞条件培养基可能成为脊髓损伤的一种替代疗法。
https://orcid.org/0009-0006-5688-5946 (Tao Liu); https://orcid.org/0000-0001-8798-509X (Xueming Chen)
中国以往关于创伤性脊髓损伤的研究主要来自区域性地区,但关于流行病学和临床特征的全国性研究很少,特别是关于治疗状况和经济负担的国家级研究还没有开展。为揭示2013-2018年发生在中国的创伤性脊髓损伤的流行病学和临床特征、治疗状况和经济负担。这项国家级、基于医院的回顾性研究于2013年1月至2018年12月从代表中国地理分区的11个省/直辖市的30家医院招募了13,465例患者,记录了患者的流行病学和临床特征、治疗状况、总费用和日常费用。使用Joinpoint回归程序,通过年度百分比变化评估了住院患者中创伤性脊髓损伤的比例、通过骨科住院患者中创伤性脊髓损伤的比例以及费用的趋势。住院患者中创伤性脊髓损伤的百分比和通过骨科住院患者中创伤性脊髓损伤的百分比总体上没有明显变化(APC=-0.5%,95%CI:-3.8至2.9和2.1%,-4.1至8.6,分别)。共有10,053例(74.7%)患者在创伤性脊髓损伤后接受了手术。然而,只有2.8%的接受手术的患者在伤后不到24h接受了手术。共有2005例(14.9%)患者接受了大剂量(≥500mg)的甲基强的松龙琥珀酸钠/甲基强的松龙(MPSS/MP)治疗,615例(4.6%)患者在8h内接受治疗。急性创伤性脊髓损伤的总费用有所下降(-4.7%,-6.3至-3.1),而每日费用没有明显变化(1.0%,-1.4至3.5)。上述结果表明,医院需要提高完成早期手术的能力,因为24h内手术与改善感觉运动恢复有关;提高临床指南的知晓率,以提高治疗效果。
https://orcid.org/0000-0001-9437-7674 (Shiqing Feng)
最近有研究表明,脑损伤后脂滴可在神经元中积聚,继而引起脂毒性,而损害神经元。然而,脊髓神经元的脂质代谢在脊髓损伤中的作用仍不清楚。此次实验拟研究脊髓损伤后神经元的脂质代谢,并希望筛选出降脂化合物来治疗脊髓损伤。结果发现,小鼠脊髓损伤后,脂滴可在病变周围的神经元中积累,且HT22细胞中的髓鞘碎片可诱导脂滴的积累。在磷脂酶降解髓鞘碎片后,产生了大量游离脂肪酸,进而增加脂滴合成、β-氧化和氧化磷酸化。过量的氧化磷酸化还可增加活性氧的生成,从而导致HT22细胞脂质过氧化和凋亡增加。高通量细胞成像分析系统筛选出溴隐亭,可作为一种降脂化合物,通过减少丝裂原活化蛋白激酶途径中细胞外信号调节激酶1/2的磷酸化来抑制胞质磷脂酶A2的磷酸化,从而抑制胞质磷脂A2对髓鞘碎片的降解,进而减少HT22细胞中脂滴的积累。同时溴隐亭治疗的脊髓损伤小鼠运动功能和神经元存活率也得到明显改善。实验结果提示,溴隐亭可通过细胞外信号调节激酶1/2/胞质磷脂酶A2通路保护脊髓损伤后神经元免受脂毒性损害。
https://orcid.org/0000-0002-7468-3372 (Chang Jiang); https://orcid.org/0000-0002-1784-0896 (Zixian Chen); https://orcid.org/0000-0001-5414-7516 (Haodong Lin)
既往研究虽已表明人工合成的凝血酶抑制剂阿加曲班可减轻脑卒中后脑水肿,并减少神经元凋亡,但其是否也对脊髓损伤有修复作用,目前尚不清楚。实验以重物打击法建立T10中度脊髓损伤大鼠模型,而后持续3d腹腔注射阿加曲班进行治疗。结果显示,阿加曲班可有效促进脊髓损伤后神经功能的恢复,抑制脊髓损伤局部凝血酶的表达和活性。继而以生物信息学分析方法揭示发现差异基因主要富集于与脊髓损伤后星形胶质细胞增生和胶质瘢痕形成密切相关的JAK2/STAT3通路。最后以蛋白印迹以及免疫荧光染色法发现阿加曲班可下调脊髓损伤大鼠脊髓中蛋白酶激活受体1表达及其介导的PAR1/JAK2/STAT3信号通路,并抑制星形胶质细胞的活化和增殖,减少脊髓中的胶质瘢痕增生。因此阿加曲班可通过凝血酶介导的PAR1/JAK2/STAT3信号通路抑制星形胶质细胞增生,从而促进脊髓损伤后神经功能的恢复。
https://orcid.org/0000-0001-9437-7674 (Shiqing Feng); https://orcid.org/0000-0003-4904-9697 (Xue Yao).
目前研究主要集中在观察细胞移植对病变脊髓后功能恢复的影响,而关于移植的细胞和/或生物材料调节脊髓损伤微环境作用的研究则较少被关注。实验首次将人类外周单核细胞重编程为诱导神经干细胞,然后将纤维蛋白-凝血酶微囊包封的人诱导神经干细胞移植到大鼠脊髓病变部位。BBB评分、电生理功能和免疫荧光/组织学分析结果显示,移植促进了脊髓损伤大鼠运动和电生理功能的恢复,减少了病变体积,并促进了病变核心处轴突神经丝的表达。对移植物和神经龛成分的分析显示,尽管移植物只存活了相对较短的时间(最多15天),但它仍能对微环境产生重要影响。诱导神经干细胞复合人纤维蛋白可减少浸润的免疫细胞数量,使小胶质细胞趋于向M2表型转化,并改变病变部位的细胞因子表达谱。表明纤维蛋白-凝血酶微囊包封的人诱导神经干细胞移植可调节脊髓损伤后的微环境,促进脊髓损伤后的功能恢复。
https://orcid.org/0000-0003-1508-510X (Zhiguo Chen)
在脊髓发育过程中,顶板分泌的骨形态发生蛋白定向了感觉神经元的命运,包括上行感觉柱的形成,尽管它们的生物学特性还不是很清楚。II型骨形态发生蛋白受体是同源受体,在胚胎发育过程中由神经前体细胞表达;然而,从胎儿脊髓中富集II型骨形态发生蛋白受体阳性神经前体细胞的体外方法并不存在。免疫荧光检测发现,II型骨形态发生蛋白受体免疫荧光表达最高的区域定位在胎龄2个月的胎儿脊髓感觉柱上。在完整的胎儿脊髓和皮质中,CD34/CD39共定位检测确定了实质和脑膜相关的II型骨形态发生蛋白受体阳性血管细胞。白血病抑制因子免疫染色确定了集中在背角和腹角神经元中的体细胞群。白血病抑制因子补充和高密度培养相结合,使培养物生长传代超过10代,同时协同增加了具有分层细胞结构的神经球的比例。这些神经球的特点是II型骨形态发生蛋白受体+/MAP2ab+/–/βIII-tubulin+/nestin–/vimentin–/GFAP–/NeuN–神经前体细胞围绕着βIII-管蛋白+/nestin+/vimentin+/GFAP+/MAP2ab-/NeuN-多能前体的异质核心。源自三潜能神经球的分离培养物含有神经元(βIII-管蛋白+)、星形细胞(GFAP+)和少突胶质细胞(O4+)谱系细胞。荧光激活细胞分选筛选的II型骨形态发生蛋白受体阳性 神经前体细胞是MAP2ab+/–/βIII-tubulin+/GFAP–/O4– 。这是首次在人类胎儿脊髓中分离出的II型骨形态发生蛋白受体阳性神经前体细胞,并对其进行了定性。结果显示,白血病抑制因子与高密度再聚集培养物协同作用,支持神经球的器官型重组,由表面II型骨形态发生蛋白受体阳性神经前体细胞表征。实验提供的体外模型能够扩增10代以上的人类胎儿脊髓细胞数量。II型骨形态发生蛋白受体在脊髓发育中的作用的研究主要依赖于小鼠和大鼠模型,通过推断得出人类发育的特性。由于小鼠生物学和人类之间的显著物种差异,包括中枢神经系统结构的解剖差异,在小鼠模型中的发现不能被认为适用于人类脊髓发育。出于这些原因,实验中的体外模型为更好地理解神经发育途径提供了一种新的工具,包括骨形态发生蛋白信号,以及脊髓损伤研究和药物治疗测试。
https://orcid.org/0000-0001-8733-2654 (Michael W. Weible II); https://orcid.org/0000-0002-8225-3671 (Tailoi Chan-Ling)
轴突球状体的形成是脊髓损伤后的常见特征。为了进一步了解介导轴突球状体形成的Ca2+的来源,实验使用了先前表征的体外小鼠脊髓模型,该模型允许对细胞外Ca2+进行精确的扰动。实验对Thy1YFP+转基因小鼠的脊髓组织进行了双光子激发显微镜成像,并应用亲脂性染料尼罗红,分别记录脊髓背柱轴突及其髓鞘的动态变化。在存在或不存在外部Ca2+的情况下,用Ca2+离子载体离子霉素选择性地从内部储存中释放Ca2+。在正常的2mM Ca2+人工脑脊液存在的情况下,离子霉素剂量依赖性地诱导髓鞘的病理变化和明显的轴突球状体形成。相反,去除外部Ca2+后 2小时内离子霉素诱导的髓鞘和轴突球状体的形成明显减少。使用在脊髓轴突中表达神经元特异性Ca2+指示剂的小鼠,实验证实了离子霉素诱导轴突内Ca2+的显著增加,但无外部Ca2+的情况下则未出现该现象。轴突周围的肿胀和由此产生的轴突-髓质界面的破坏往往先于轴突球状体的形成,并与之呈负相关。用库控钙内流阻断剂YM58483(500nM)预处理可明显减少髓鞘损伤和轴突球体的形成。总之,这些数据显示,离子霉素诱导的内部Ca2+储存的耗竭和随后通过库控钙内流的外部Ca2+进入有助于髓鞘的病理变化和轴突球状体的形成,从而为保护中枢有髓纤维提供了新的标靶。
https://orcid.org/0000-0003-1004-8991 (David P. Stirling)
Fidgetin是一种微管切割蛋白,可通过修剪微管不稳定区来调节轴突生长、轴突再生和细胞迁移。由于微管不稳定区对于轴突起始、延伸和导航至关重要,因此通过调节Fidgetin以影响微管不稳定区可能具有促进脊髓损伤轴突再生的意义。实验构建了脊髓损伤和坐骨神经损伤大鼠模型,与脊髓损伤相比,周围神经损伤后不稳定微管中酪氨酸化微管蛋白持续升高,而Fidgetin水平则明显下降。且Fidgetin耗竭可增强脊髓损伤后轴突的再生,并伴随微管正末端紧密结合的微管末端结合蛋白3的显著增加。继而以RNA干扰方法敲低微管末端结合蛋白3或Fidgetin,发现微管末端结合蛋白3缺失没有改变Fidgetin表达,但Fidgetin缺失却可显著增加微管末端结合蛋白3的表达和分布,且可释放更多的微管末端结合蛋白3进入生长中的神经突起,从而增加酪氨酸化微管蛋白水平。然后在敲除微管末端结合蛋白3的同时过表达Fidgetin,发现Fidgetin可通过与微管末端结合蛋白3结合靶向正在生长中的微管末端,修剪酪氨酸修饰的微管;而缺少Fidgetin时,微管不稳定区延长,从而增加轴突的长度和分支数量。因此提示Fidgetin可作为促进脊髓损伤后轴突再生的新治疗靶点,且该研究揭示了Fidgetin优先切割不稳定微管的机制。
https://orcid.org/0000-0003-1168-6119 (Mei Liu)
贝沙罗汀已被证明能促进自噬,但其尚未应用于脊髓损伤的治疗中。为了解其对脊髓损伤的影响,实验建立了小鼠T11-T12脊髓挫伤模型,然后连续5d腹腔注射贝沙罗汀进行治疗。结果发现,贝沙罗汀可有效减少损伤脊髓中胶原沉积和病变神经元数量,增加神经细胞突触数量,减轻氧化应激,抑制细胞焦亡,促进运动功能的恢复,减少小鼠死亡。进一步研究发现,以3-甲基腺嘌呤抑制自噬可逆转贝沙罗汀对脊髓损伤的作用。同时贝沙罗汀还可增强促进脊髓损伤后转录因子E3的激活和核易位,并激活AMPK-SKP2-CARM1和AMPK-mTOR信号通路,而静脉注射TFE3 shRNA或腹腔注射AMPK抑制剂化合物C均可抑制贝沙罗汀的作用。提示贝沙罗汀可通过AMPK-SKP2-CARM1和AMPK-mTOR信号通路调节转录因子E3核易位,促进细胞自噬,以降低活性氧平,并抑制细胞焦亡,最终改善脊髓损伤后运动功能。
https://orcid.org/0000-0001-7795-576X (Kailiang Zhou); https://orcid.org/0000-0001-8277-7590 (Sunren Sheng); https://orcid.org/0000-0003-0540-4250 (Xingyu Wang); https://orcid.org/0009-0007-9455-5961 (Haojie Zhang); https://orcid.org/0000-0003-1395-3364 (Hao-Jie Zhang)
蝾螈的脊髓再生能力极强。如能探明蝾螈脊髓再生的分子机制,将为实现哺乳动物脊髓再生研究提供思路。实验选取在中国广泛分布的东方蝾螈作为研究对象,行脊髓横断构建脊髓损伤模型。可见其在损伤4和10d时存在明显的结缔组织再生,受损的脊髓被逐渐修复,在损伤3周内基本可恢复运动功能,且在脊髓损伤恢复期间,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞持续增殖,并充满整个灰质,且成熟神经元数量也逐渐增加。继而以转录组测序筛选出蝾螈脊髓再生过程中存在13059种差异表达基因,经差异基因的趋势分析其中有4273种基因持续下调,1564种基因持续上调。再次筛选可见,Plp1,Krt75,Kbp等基因与哺乳动物脊髓再生有关。KEGG分析结果显示,差异表达的基因主要与免疫系统、细胞外基质以及细胞内的能量和蛋白质代谢有关。综上,东方蝾螈这些在脊髓再生中差异表达的基因可为进一步研究哺乳动物脊髓损伤及修复提供帮助。
https://orcid.org/0000-0001-5103-054X (Jun Li)
椎管狭窄患者容易受到钝性损伤而诱发中央管综合征,寻找合适的动物模型有助于研究此类损伤的发病机制和治疗方法。实验基于小鼠颈部解剖结构,以5和10g/mm2压缩重量压迫C6脊髓建立急性钝性创伤性脊髓损伤模型,以模拟颈脊髓中央管综合征。行为学检测证实该模型符合颈脊髓中央管综合征特征,即前肢运动功能明显受损,而后肢基本上保留了运动和感觉功能。进一步苏木精-伊红染色发现,模型小鼠的脊髓病变区域都位于中央管附近的灰质,而外侧白质几乎未见损伤。核磁共振成像观察可见,轻度和重度损伤后,脊髓病变中心存在明显的低信号区。另外,免疫荧光染色提示脊髓白质区神经束损伤较小,且持续存在慢性炎症反应。实验结果提示,这种新型中央管综合征小鼠模型可作为临床前研究的模型,且中央管综合征模型中灰质是最易受影响的区域,会影响其支配的运动功能。
https://orcid.org/0000-0002-5939-138X (Shiqing Feng)
维持血脊髓屏障完整性对脊髓损伤的恢复至关重要。铁死亡参与了脊髓损伤的病理改变,而铁死亡是否参与了脊髓损伤后血脊髓屏障的破坏尚无定论。实验在大鼠挫伤性脊髓损伤后腹腔注射铁死亡抑制剂liproxstatin-1(Lip-1)。发现Lip-1可以:(1)改善脊髓损伤大鼠的运动功能和电生理表现;(2)通过上调紧密连接蛋白的表达来维持血脊髓屏障的完整性;(3)抑制脊髓损伤后的内皮细胞铁中毒,这表现在内皮细胞标志物大鼠内皮细胞抗原1和铁死亡标志物酯酰辅酶A合成酶长链家族成员4和15-脂氧合酶的免疫荧光结果上。此外,由于Lip-1对血脊髓屏障完整性的保护,炎症细胞的招募以及星形胶质细胞出现减少。体外实验结果显示,Lip-1可通过上调谷胱甘肽过氧化物酶4和下调酯酰辅酶A合成酶长链家族成员4和15-脂氧合酶减轻体外大脑内皮细胞铁中毒。总之,Lip-1通过抑制内皮细胞的铁死亡和维持血脊髓屏障来促进脊髓损伤的恢复。
https://orcid.org/0000-0003-4904-7697 (Xue Yao); https://orcid.org/0000-0001-9437-7674 (Shiqing Feng)
脊髓型颈椎病是成人最常见的导致脊髓功能障碍的疾病之一,其病理机制在于脊髓受到椎管内骨性结构或软组织的慢性压迫。铁死亡是许多神经退行性疾病的一个重要病理过程;然而,它在慢性脊髓压迫中的作用仍不清楚。实验建立了慢性压迫性脊髓损伤大鼠模型,通过转录组测序技术发现了铁死亡相关通路在这个模型中富集。通过透射电子显微镜和丙二醛定量分析,研究证实铁死亡的活性在压迫第4周达到峰值,而在第8周时减弱,与神经功能显著负相关。qPCR、免疫荧光和免疫印迹检测发现,在脊髓压迫后第4周神经元中的抗铁死亡分子谷胱甘肽过氧化物酶4和MAF BZIP转录因子G的表达受到抑制,但在8周时增加。MAF BZIP转录因子G和Nrf2之间的相互作用在慢性脊髓压迫后第4周下调,却在第8周时被显著上调。谷胱甘肽过氧化物酶4和MAF BZIP转录因子G蛋白的表达呈正相关,与神经功能生理变化的趋势呈负相关。研究揭示了慢性脊髓压迫大鼠在伤后8周内的转录组以及铁死亡活性的变化,抑制铁死亡有利于慢性压迫性脊髓损伤后神经功能的恢复。实验结果为了解抗铁死亡疗法在治疗脊髓型颈椎病中的潜力提供了见解。
https://orcid.org/0000-0003-4809-9516 (Yang Duan)
DNA甲基化是疾病发生发展的重要表观遗传调节因子;DNA甲基化调控已被证明与多种脊髓损伤相关的功能反应密切相关。为了解DNA甲基化在脊髓损伤中的作用,实验构建了小鼠脊髓损伤后0-42d的连续简并代表性亚硫酸氢盐序列文库(RRBS)。发现脊髓损伤后, DNA甲基化水平整体降低,尤其是非CpG类。基于整体DNA甲基化模式的相似性和层次聚类,使用分层聚类方法可将脊髓损伤分为3个阶段,第0-3天、第7-14 天、第28-42天,分别代表了脊髓损伤的早中晚期。非CpG甲基化尽管占总甲基化丰度的比例很小,但其水平,包括CHG和CHH甲基化水平,显著降低。启动子区、5'非翻译区、外显子、内含子和3'非翻译区中的非CpG甲基化水平均显著下降,而CpG甲基化水平几乎没有改变。约一半的差异甲基化区位于基因间区,CpG和非CpG区的其他差异甲基化主要聚集在内含子区中,且其中DNA甲基化水平最高。接下来分析了启动子区与差异甲基化区相关基因的功能。根据基因本体分析的结果,DNA甲基化与脊髓损伤的多项基本功能反应有关,包括神经元突触连接建立和轴突再生。令人惊讶的是,CpG甲基化和非CpG甲基化均与胶质细胞或炎性细胞功能反应无关。综上,此次实验得到了脊髓损伤后DNA甲基化的动态模式,并发现非CPG甲基化降低是小鼠脊髓损伤后重要的表观遗传靶点。
https://orcid.org/0000-0001-9494-8211 (Liming Cheng)
酪氨酸蛋白激酶受体A4在神经系统中广泛表达。在运动神经元病中,酪氨酸蛋白激酶受体A4信号通路在调节运动神经元死亡中起着重要作用,而铁死亡是运动神经元死亡的一种重要方式。为了解EphA4信号是否参与脊髓缺血再灌注损伤中细胞铁死亡。实验通过夹闭左颈动脉和左锁骨下动脉14min建立脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型,可见脊髓缺血再灌注损伤可导致脊髓前角神经元中酪氨酸蛋白激酶受体A4表达增加,与此同时,铁死亡相关指标明显恶化,且具有铁死亡特征的线粒体数量显著增加,并伴有运动神经功能和血脊髓屏障通透性恶化以及运动神经元死亡。而抑制酪氨酸蛋白激酶受体A4后,上述异常指标均明显恢复。然而,鞘内给予铁死亡诱导剂Erastin则可抵消抑制酪氨酸蛋白激酶受体A4的有益作用。进一步通过质谱和PubMed检索筛选与酪氨酸蛋白激酶受体A4相互作用的Beclin1和Erk1/2蛋白,发现抑制酪氨酸蛋白激酶受体A4表达可导致与Beclin1的结合减弱,磷酸化Beclin1减少,且Beclin1与XCT复合物合成降低。且抑制酪氨酸蛋白激酶受体A4还能降低酪氨酸蛋白激酶受体A4和磷酸化Erk1/2的结合,同时下调c-Myc、转铁蛋白受体1以及磷酸化Erk1/2水平。此外发现,酪氨酸蛋白激酶受体A4与磷酸化Beclin1和磷酸化ERK1/2在前角神经元中共定位。综上,酪氨酸蛋白激酶受体A4可通过促进Beclin1和XCT复合物的形成,激活Erk1/2/c-Myc/转铁蛋白受体1轴,参与调控脊髓缺血再灌注损伤中前角脊髓运动神经元的铁死亡。
https://orcid.org/0000-0003-4250-2247 (Hong Ma)
脊柱手术后,神经元会向硬膜外部位分泌大量P物质,而后者与巨噬细胞分化和瘢痕纤维化疾病有关,但是P物质在硬膜外瘢痕纤维化中的具体作用和机制仍不清楚。为此,实验构建了L1-L3椎板切除小鼠模型,可见背根神经节神经元以及伤口部位浸润的巨噬细胞能释放P物质。进而在体外实验中发现,M1巨噬细胞分泌的P物质能促进M1巨噬细胞向M2巨噬细胞的分化。接下来的高通量mRNA测序结果表明,鞘脂代谢通路可能参与P物质调节M2分化。具体而言,鞘磷脂代谢通路中的鞘磷脂合成酶2可促进P物质调节巨噬细胞的M2分化。且鞘磷脂合成酶2抑制剂LY93抑制鞘磷脂合成酶2可抑制M2分化。此外,P物质还能促进中性粒细胞胞外陷阱网的形成,进一步促进M2分化。最后在椎板摘除小鼠模型中发现,P物质受体抑制剂RP67580可显著减少伤口部位M2巨噬细胞,减轻硬膜外瘢痕,并降低瘢痕组织中纤维连接蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原含量。上述结果表明,P物质可通过鞘磷脂合成酶2和中性粒细胞胞外陷阱网促进硬膜外纤维化中巨噬细胞的M2分化,这将为治疗硬膜外瘢痕提供了新的策略。
https://orcid.org/0000-0001-5925-0168 (Ming-Shun Zhang); https://orcid.org/0000-0003-3756-3627 (Jun Liu)
由于中枢神经系统再生能力非常有限,且对脊髓损伤有效的治疗方法很少,因此寻找促脊髓损伤后结构和功能恢复的药物先导分子具有重要的意义。有研究显示,多肽可显著地促损伤组织修复和再生,且由于两栖动物的脊髓再生能力很强,但目前少有研究探讨两栖动物脊髓来源的多肽对脊髓损伤的影响。因此此次实验首次从中国特有两栖动物花臭蛙脊髓中成功分离鉴定一种新型多肽—VD11(氨基酸序列为VDELWPPWLPC)。体外实验表明,VD11可促进脂多糖诱导BV2细胞中神经生长因子和脑源性神经营养因子的分泌以及缺氧损伤PC12细胞的增殖和突触延长。体内实验表明,椎管内注射VD11可明显促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复,减轻其病理损伤,并促进轴突的再生。进一步RNA测序和蛋白质印迹结果显示,其作用可能与AMPK和AKT信号通路的激活相关。综上,实验成功发现了一种新型两栖动物来源肽VD11,可促进脊髓损伤后结构和功能的恢复。
https://orcid.org/0000-0003-3210-8908 (Xin-Wang Yang); https://orcid.org/0000-0002-0983-4365 (Ying Wang);
https://orcid.org/0000-0003-4799-6717 (Jun Sun)
有研究发现,血清反应因子有助于周围神经的轴突再生,但其在中枢神经损伤后的作用仍不明确。为此,实验构建了T9-T10脊髓横断大鼠模型,发现损伤脊髓灰质神经元中血清反应因子的表达随着时间的延长而逐渐上调,第7天时达到峰值,随后逐渐下降。为进一步了解血清反应因子的作用,使用慢病毒载体过表达和沉默脊髓组织中血清反应因子,发现血清反应因子过表达可促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复,生物素葡聚糖胺顺行示踪可见血清反应因子过表达可增加损伤脊髓中新生神经纤维的数量,同时透射电镜可见下轴突和髓鞘明显恢复,且沉默血清反应因子则表现出相反的迹象。提示血清反应因子在脊髓损伤后运动功能的恢复中发挥了至关重要的作用,其潜在机制可能与轴突再生的调节有关。
https://orcid.org/0000-0002-2298-4720 (Fei Huang)
越来越多的证据表明,线粒体动力学失衡在脊髓损伤继发性损伤病理过程中起着至关重要的作用。作者既往研究已发现光生物调节可有效改善脊髓损伤大鼠的运动功能,但其具体机制并未明确。为探索光生物调节对脊髓损伤后线粒体动力学的影响,实验连续14d,每天60min的光生物调节(810 nm,150 mW)对脊髓损伤大鼠模型进行治疗,透射电镜可见在脊髓损伤急性期(1d)和亚急性期(7和14d),大鼠脊髓神经元线粒体中存在肿胀和碎片化的迹象,而光生物调节可在亚急性期显著缓解脊髓组织中线粒体动力学失衡,并减轻神经元死亡,改善大鼠的后肢运动功能,且这一作用存在时间积累性。结果提示光生物调节直接靶向神经元内的线粒体,缓解线粒体动力学失衡诱导的神经元凋亡,进而促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。
https://orcid.org/0000-0003-0852-1196 (Xue-Yu Hu); https://orcid.org/0000-0002-7573-1583 (Zhe Wang)